黄芪、三七不同剂量配伍对肾小球系膜细胞增殖的影响

　　作者：刘明平，黄兆胜，吴庆光，韦品清 作者单位：广州中医药大学：1. 中药学院;2. 护理学院，广东广州 510405

　　【摘要】 目的 通过考察通脉口服液方中黄芪、三七不同剂量配伍对肾小球系膜细胞增殖的影响，筛选其最佳配伍剂量。方法 采用血清药理学方法，制备不同剂量配伍的通脉含药血清，体外检测其对肾小球系膜细胞(GMC)增殖的影响。结果 通脉口服液，黄芪、三七不同剂量配伍含药血清，无论在正常培养条件下还是在脂多糖(LPS)刺激条件下，均对GMC增殖有一定的抑制作用;各剂量配比组之间比较，通脉3∶1含药血清抑制作用优于通脉6∶1、1.5∶1含药血清。结论 原方黄芪、三七剂量按3∶1配比具有一定的合理性。

　　【关键词】 黄芪 三七 肾小球系膜细胞 配伍研究

　　Effect on proliferation of glomerular mesangial cell by the dose　compatible proportion between Radix Astrsgaliand Radix Notoginseng in 　Tongmai Oral Liquid

　　LIU Mingping, HUANG Zhaosheng, WU Qingguang, WEI Pinqing

　　1. College of Traditional Chinese Medicine; 2. College of Nursing Science,Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, China

　　ABSTRACT: Objective To study the effect on proliferation of glomerular mesangial (GMC) cell by the dose compatible proportion between Radix Astrsgali and Radix Notoginseng in Tongmai Oral Liquid (TMOL) so as to select the optimal dose proportion. Methods We used serological pharmacological methods to prepare Decoction of Tongmai of different dose proportions and assay its effect on the proliferation of GMC to confirm the best dose compatible proportion between Radix Astrsgali and Radix Notoginseng of Decoction of Tongmai. Results Both TMOL and the different proportions between Radix Astrsgali and Radix Notoginseng (6∶1, 3∶1, 1.5∶1) of Decoction of Tongmai could inhibit the proliferation of GMC cultured either in fetal cow serum (FCS) or in FCS plus lipoplysaccharide. The inhibitory effect of Decoction of Tongmai (3∶1) group was better than both Decoction of Tongmai 6∶1 and Decoction of Tongmai 1.5∶1. Conclusion The dose compatible proportion between Radix Astrsgali and Radix Notoginseng in TMOL was reasonable.

　　KEY WORDS: Radix Astrsgali; Radix Notoginseng; glomerular mesangial cell; study on compatible proportion

　　通脉口服液为治疗慢性肾炎的有效经验方，方中黄芪、三七剂量按3∶1经验使用。为进一步寻找其最佳配伍比例，本研究以肾小球系膜细胞(glomerular mesangial cell, GMC)增殖为药效学导向指标，对方中黄芪、三七的不同剂量配伍进行了筛选研究。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物

　　SD雄性大鼠25只，SPF级，由广州中医药大学实验动物中心提供，合格证号：0003467，许可证号：SCK(粤)20030001。

　　1.2 试剂及仪器

　　CO2恒温培养箱，美国Harris公司产品;倒置相差显微镜，日本Nikon公司产品;酶联免疫检测仪，美国BioRad公司Smartspec3000型;DMEM培养液、四甲基偶氮唑盐(MTT)、脂多糖(LPS)均为Sigma公司产品;标准胎牛血清(FCS)为Gibco公司产品。

　　1.3 实验药物

　　通脉口服液：10mL/支，每mL含黄芪0.3g、三七0.1g，由广东省中医院提供，批号200410264;通脉(6∶1、3∶1、1.5∶1)不同配比水煎液：取复方药材，加10倍水浸泡12h，加热至沸腾，提取2次，每次2h，滤过、合并滤液、浓缩、定容至相当于1g生药/mL，由广州中医药大学中药学院实验中心提供。

　　1.4 实验方法

　　1.4.1 含药血清的制备

　　将SD大鼠随机分为5组，即通脉口服液组、通脉(6∶1、3∶1、1.5∶1)不同配比组及空白对照组，每组5只。各药物组均按临床成人用量的20倍即8g(生药)/kg体重灌胃给药，连续7d。第7天重复给药2次，间隔时间2h。并于末次给药后1h，无菌操作，眼眶静脉取血，静置1h，待血凝固后1500r/min离心10min，分离血清，并将含药血清置于56℃水浴箱中，水浴30min灭活处理，置于-20℃冰箱保存备用。

　　1.4.2 肾小球系膜细胞(GMC)的培养

　　GMC由武汉大学典藏细胞库存提供(编号：HBZY1)，培养方法参考文献[1]：加入10g/L FCS的DMEM培养液，吸掉培养液，加约2mL胰酶消化液(内含2.5g/L胰蛋白酶和0.2g/L EDTA)，轻摇培养瓶，使消化液流遍所有细胞表面;轻轻吹打细胞，吸出消化液和细胞，加入15mL离心管内，1500r/min离心10min，吸出上清，加入培养液，再次1500r/min离心10min，吸出上清，加入含10g/L FCS的培养液;分瓶，放入CO2恒温培养箱(37℃、50mL/L CO2、饱和湿度)培养。2～3d换液一次。

　　1.4.3 含药血清浓度的筛选

　　取细胞悬液于相差显微镜下计数，用含10g/L FCS的DMEM调整细胞密度为7×104/mL，转种于96孔培养板中，100μL/孔，即每孔细胞数为7×103;37℃、50mL/L CO2、饱和湿度条件下培养24h;各孔均换液，加入不含FCS的DMEM培养液200μL，以同步各组细胞于G0期;同步24h后，各孔分别加入50、100、200mL/L不同浓度的通脉口服液含药血清，同时以相应浓度的空白血清作为对照。每组设6个复孔，37℃、50mL/L CO2、饱和湿度条件下培养48h，MTT比色法检测细胞增殖。

　　1.4.4 不同剂量配比对GMC增殖的影响

　　实验分为：空白血清组(100mL/L正常鼠血清)、通脉口服液含药血清组(加100mL/L含药血清)、通脉6∶1含药血清组(加100mL/L含药血清)、通脉3∶1含药血清组(加100mL/L含药血清)、通脉1.5∶1含药血清组(加100mL/L含药血清)、LPS组(加LPS 10mg/L和空白血清)、LPS通脉口服液含药血清组(加LPS 10mg/L和100mL/L含药血清)、LPS通脉6∶1含药血清组(加LPS 10mg/L和100mL/L含药血清)、LPS通脉3∶1含药血清组(加LPS 10mg/L和100mL/L含药血清)、LPS通脉1.5∶1含药血清组(加LPS 10mg/L和100mL/L含药血清)。每组设6个复孔。于培养48h时分别取出相应的培养板，每孔加入MTT 20μL，继续培养4h。小心吸弃各孔培养液，加入100μL DMSO，室温避光，轻轻震荡10min，使结晶充分溶解。选择490nm波长条件下用酶标仪测定A值。

　　1.5 统计学处理

　　实验数据以±s表示，计量资料用方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 不同浓度LPS不同培养时间对GMC增殖的影响

　　结果显示，1.0、10mg/mL LPS在24、48、72h对GMC增殖有明显刺激作用，与空白血清组相比,差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01);100mg/L LPS在12、24h对GMC增殖有明显刺激作用，与空白血清组相比，差异有统计学意义(P<0.01);1.0、10mg/mL LPS在48、72h对GMC增殖刺激作用强于100mg/L LPS，差异有统计学意义(P<0.05或0.01)。提示LPS 10mg/L为GMC增殖的最佳刺激浓度(表1)。表1 不同浓度LPS不同培养时间对GMC增殖的刺激作用(略)

　　2.2 不同浓度通脉口服液含药血清对GMC增殖的影响

　　结果显示，50、100、200mL/L含药血清的通脉口服液均能抑制GMC增殖，与空白血清组比较差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01)，而各含药血清组间比较差异无统计学意义(P>0.05，表2)。表2 不同浓度通脉口服液含药血清对GMC增殖的影响(略)

　　2.3 不同剂量配比对正常培养条件下及LPS刺激下GMC增殖的影响

　　结果显示，正常培养及LPS刺激条件下，通脉口服液及通脉不同剂量配比含药血清均能抑制GMC的增殖，与空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01);通脉口服液及通脉3∶1含药血清抑制GMC增殖作用强于通脉6∶1及1.5∶1含药血清，差异有统计学意义(P<0.05)，通脉口服液与通脉3∶1含药血清抑制作用相当，组间比较无显著性差异(P>0.05，表3、表4)。表3 通脉不同剂量配比对正常培养条件下GMC增殖的影响(略)表4 通脉不同剂量配比对LPS刺激下GMC增殖的影响(略)

　　3 讨 论

　　配伍是方剂发挥药效的关键，方剂通过配伍使临床疗效得到提高。长期的中医临床及研究认为，复方药物的组成相同但因剂量或比例不同而疗效迥异，因此即使相同的药物组成，因采取不同的剂量比例会产生不同的治疗效果。基于此，本研究以肾小球系膜细胞(GMC)增殖为药效学导向指标，对通脉口服液中黄芪、三七的配伍剂量进行了研究。结果显示，原方黄芪、三七按3∶1剂量配伍为最佳剂量配伍。王氏等[2]提出了方剂配伍新模式—有效组分配伍模型，并认为该模式有可能成为方剂配伍的新的继承与创新的延伸。国内学者在此方面进行了有益的探索，如丁氏等[3]在对黄芩汤有效组分配方抗大鼠溃疡性结肠炎的研究中发现，黄芩苷∶白芍总苷∶甘草酸比例为6∶2∶1时对溃疡的修复效果最明显;赵氏等[4]发现温肾咳喘片组分中厚朴、蛇床子CO2超临界萃取物与甘草提取物的最佳剂量配伍比例为4∶3∶3时，止咳平喘效果最理想。我们课题组也对通脉复方多糖和复方皂苷间剂量配伍进行了的研究(另文发表)。近年来冯氏等[5]提出“方剂配伍代谢”关系，认为中药药效成分的体内代谢特征与其配伍变化存在一定的对应关系。近年来尽管中药化学成分的体内代谢转化研究逐渐得到了重视，但有关“方剂配伍代谢”的关系，目前还缺乏比较系统的研究，应进一步加强。

　　【参考文献】

　　[1]潘晓勤，王晓燕. 肾小球系膜细胞培养及鉴定 [J]. 南京医科大学学报, 1995, 15(1):222223.

　　[2]王阶，王永炎，杨戈. 中药方剂配伍理论研究方法和模型 [J]. 中国中药杂志, 2005, 30(1):68.

　　[3]丁晓刚，傅延龄. 黄芩汤有效成分配方抗大鼠实验溃疡性结肠炎的实验研究 [J]. 北京中医药大学学报, 2003, 16(1):4548.

　　[4]赵学军，李卫民，熊天琴，等. 温肾咳喘片组分的正交法优选及其主要药学效实验研究 [J]. 成都中医药大学学报, 2005, 28(1):5659.

　　[5]冯年平，都广礼，狄斌，等. 试论中药方剂配伍代谢关系 [J]. 上海中医药杂志, 2007, 41(10):69.