解脲脲原体诊断技术研究进展

　　作者：陈婷,综述,颜继忠,审校　　作者单位：浙江工业大学药学院微生物与生化药学专业

　　【关键词】 解脲脲原体,诊断技术

　　解脲脲原体(Ureaplasma urealyticum，Uu)是属于柔膜纲支原体目支原体科的支原体属的微生物。目前，解脲脲原体可分为两大生物群和14个血清型，生物群1或Parvo，包括血清型1、3、6和14;生物群2或T960，包括其余的10个血清型[1，2]。但各型与疾病关系尚未明确。

　　Uu除可引起非淋球菌尿道炎外还与许多泌尿生殖道疾病相关。Uu的感染是绒毛羊膜炎的病因，并且和胎儿的羊膜早破、早产、围生期病态和病死率相关[3]。此外，它还是引起呼吸系统疾病和脑膜炎的重要因素[4]。近年来，Uu作为主要病原体的报道增多，但是许多感染者临床症状不典型，因此，早期、简便、快速，特异地诊断Uu，对临床的诊断、疾病的早期治疗和预防其流行等具有重要的意义。目前，对解脲脲原体的诊断方法主要有培养法、免疫学法和分子生物学法。

　　1 培养法

　　支原体是介于细菌和病毒之间的一类缺乏细胞壁的微生物,能在人工培养基上生长,但营养条件要求较高,一般有液体、固体和双相培养法。Uu的液体培养主要是以牛心浸出液、肉汤培养基为基础，添加10%～20%小牛血清或马血清、酵母、0.1%尿素、抗生素、抑菌剂和酚红指示剂等[5]。支原体中，仅Uu在生长的过程中会分解尿素，产生NH3，使培养基颜色变红。因此可通过观察培养基颜色的改变来判断Uu的存在。涂少华等[6]改进培养基营养组成，调整营养结构，改善抑菌能力。改良的培养基同原Uu液相培养基相比，具有分离阳性高、生长速度快及抑制杂菌能力强等优点。虽然肉汤颜色的变化在一定程度上已经提示了支原体培养可能为阳性,但是仍然存在着假阳性问题[7]。细菌和真菌的污染均会影响检验结果，因此还需转种琼脂固体培养基，观察典型的菌落形态和有关生化反应[8]。在接种后第1～3天出现的圆形棕色菌落,直径在15～60μm,判断为Uu;若接种第3～4天出现油煎蛋样菌落,直径为200～300μm,判断为人型支原体(mycoplasma hominis,Mh)。故Uu的分离和鉴定要包括肉汤增菌和转种固体平板。李婷等[9]改进固体培养基:含有多胨等基础营养成分和0.9%琼脂,增加血清含量,添加细胞培养液促进支原体生长;抑菌剂除传统的青霉素外还添加了非抗生素类抑菌成分,操作简便，污染率低。

　　Uu的液体培养法设备简单、经济，但存在假阳性和假阴性的结果，还需固体培养鉴定。其耗时长，操作技术高，培养基复杂等一系列因素并不利于早期的临床快速、特异诊断。

　　2 免疫学法

　　代谢抑制试验，根据特异性抗体能阻止支原体生长及代谢这一特性,对支原体采用发酵抑制试验进行血清抗体测定。血清中有特异性抗体存在时,加入血清的培养基中支原体的生长及代谢受到抑制,间接的阻止培养基的颜色改变[10]。单克隆或多克隆免疫荧光法(IFA)和酶免疫实验(ELISA):Fedoua等[11]对97株Uu进行实验，ELISA法则其中86株可进行分型鉴定，IFA法，则89株可进行分型鉴定，86株两种方法都可以，并认为ELISA比较合适用于临床诊断分型。如不能用ELISA则再用IFA补充实验。邹先彪[12]用夹心法检测Uu抗原并与传统的培养法相比较，结果ELISA夹心法敏感度为92.6%，特异度为97.4%，最低能够检测出蛋白含量为5～10ng/ml的Uu抗原。另外，国外部分文献报道了ELISA在Uu诊断中的应用，显示了其良好的发展前景[13]。还有斑点测试法[14]和后来发展起来的快速检测抗原的免疫组化法[15]，即亲和素-生物素-酶复合物技术(ABC法)检测Uu临床感染者。该法简便快速(3h左右),不需要特殊的设备,标本处理后可长期保存等优点,在临床诊断中有实用价值。

　　虽然免疫学法还未成为标准的Uu诊断技术，并且检测中也受多种因素的影响，但其快速、简便、灵敏度高、易于标准和商品化等优势，使其在临床快速检测上具有很好的发展前景并易于开发成商品化试剂盒。

　　3 分子生物学方法

　　虽然培养法是Uu检测的“金标准”，但耗时长、敏感性低、易污染等缺点，使得近年来聚核酶链式反应(PCR)法渐渐显现了其在检测上的优势。研究者根据Uu的MB基因，16S rRNA基因和脲酶基因设计了各种PCR检测方法[16]，如传统PCR、实时PCR、荧光定量PCR、反相斑点杂交、多重PCR等。Jongyoun等[17]以Uu的脲酶基因为靶基因，设计了两个生物群的共同引物(UU-1524R:5‘-TTCCTGTTGCCCCTCAGTCT-3‘ and UU-1613F: 5‘-AAGGTCAAGGTATGGAAGATCCAA-3‘)和两个生物群的特异探针TaqManprobes(UU-parvo:5‘-FAM-TCCACAAGCTCCAGCAGCAATTTG-TAMRA-3’andUU-T960: 5‘-VIC-ACCACAAGCACCTGCTACGATTTGTTC-TAMRA-3‘)进行实时PCR并与传统PCR和培养法进行比较，发现此法可以同时对临床Uu标本进行检测和分群，且较传统方法更敏感。Cao等[16]设计了两种实时PCR实验，快速、特异、灵敏、定量地检测Uu并进行分群。实时PCR技术对于Uu的定量检测和简单分群的发展，将对病原体发病机制和流行病学的研究起到很大的帮助。

　　荧光PCR技术是基于传统PCR技术并结合光谱技术而发展起来的一种更灵敏，更特异，更精确的核酸检测技术。张华黎等[18]用荧光定量PCR动态检测女性生殖道Uu，结果定量准确，重复性高，能动态反应患者治疗前、后病原体动态变化及与临床的关系，且整个过程中避免了传统PCR需后处理的问题，减少了污染。荧光偏振与模板指导的末端延伸反应检测技术(TDI-FP),检测偏振光,增加检测灵敏度。王香玲等[19]在一个PCR反应体系进行多重PCR，用TDI-FP技术检测PCR产物,使得对混合感染的检测快速、特异、简便，降低检测成本。

　　张帝开[20]在荧光定量PCR的技术上将Uu不同基因型的特异探针固定在硝酸纤维素膜上与扩增好的DNA进行杂交显色，首次用反相斑点杂交将U.parvum群(微小脲原体，即Biovar 1/Parvo群)所有4个基因型明确区分并对U.urealyticum群(即Biovar 2/T960群)也适用。

　　刘晓虹等[21]建立一种检测Uu生物群1、2的聚合酶链反应-毛细管电泳(PCR-CE)方法,研究Uu生物群与男性非淋菌性尿道炎(NGU)的关系。结果PCR-CE法的敏感性为10拷贝/50μl,而且仅特异扩增Uu生物群1、2,而对于HBV及尿道中常见的一些细菌、真菌等不产生扩增。

　　Shi等[22]设计并优化了寡核苷酸微点阵与多重PCR结合的技术,在同一系统中检测了淋球菌，沙眼衣原体和解脲脲原体。Cao等[23]也在基于不均匀多重PCR并结合寡核苷酸微点阵技术同时检测了沙眼衣原体和解脲脲原体。该技术的实验结果可靠，为多重感染和大量标本的检测提供了一个高速，高通量的平台。可以说，对临床性传播疾病的诊断具有较好的优势。

　　PCR技术凭借着快速，敏感，特异等优点逐渐显示出了其临床诊断的优越性。PCR技术与其它生物学技术的结合，使得鉴定和分型的信息在24～48h内就可获得，并且可动态地检测患者治疗前后的变化。随着性传播疾病患者数量的逐年增加，多重PCR技术更显示了其快速，高效和经济的特点。但是，传统的PCR技术，造成污染的可能性较多，容易出现假阳性的结果，在临床的诊断还需进一步研究。

　　4 结语

　　Uu的研究已有40多年的历史了，实验室及临床鉴定方法各异。虽然培养法是Uu检测的“金标准”，但还需转种固体培养基鉴定、耗时长、操作技术高、培养基复杂，并不利于早期的临床快速诊断。随着免疫学法和核酸技术的深入发展，快速、敏感、特异、精确和经济的检测技术将会被临床诊断所青睐。其中，在检测Uu的同时能检测多个病原体的技术会更加满足患者的时间和经济需求。

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