环状定点诱变技术在单碱基定点诱变中的应用

　　作者：周亚芹,张洪梅,董艳,苏青　　作者单位：上海交通大学医学院附属新华医院 内分泌代谢科，上海 200092)

　　【摘要】目的 采用环状定点诱变技术将重组真核表达质粒pcDNA3.1hTSHR中hTSHR cDNA序列上发生突变的单碱基诱变回正常的序列。方法 设计1对含预期突变的完全互补的诱变引物，以环状质粒为模板进行PCR扩增，得到带缺口的突变质粒，酶消化去除模板质粒，将PCR产物转化DH5α感受态细胞进行缺口修复和克隆。结果 DNA测序表明，在预期位点已成功发生诱变，且目的基因其他部位的碱基序列均未发生随机突变。结论 环状定点诱变技术是一种高效、简便、快捷的诱变方法，通过该方法成功实现了目的碱基的定点诱变，为后续研究奠定了基础。

　　【关键词】 环状定点突变,聚合酶链反应,质粒,人促甲状腺激素受体

　　Abstract:Objective To mutate single base of hTSHR cDNA subcloned into pcDNA3.1 to normal base sequence by circular sitedirected mutagenesis technology. Methods A pair of completely complementary primers with desired mutation was designed,circular plasmid was used as the template,the nicked mutational plasmids were obtained by PCR amplifying.Parental plasmids were digested by specific enzyme.Digested PCR products were transformed into E.coli competent cells for repairing nick and amplifying.Results As shown by DNA sequencing, desired mutation was successfully completed,and other bases of target gene were not mutated.Conclusion Circular sitedirected mutagenesis technology is an efficient and rapid method of sitedirected mutagenesis.Target base was successfully mutated by this method,which provides a basis for further study.

　　Key words:circular sitedirected mutagenesis;polymerase chain reaction;plasmid;human thyroid stimulating hormone receptor

　　(Modern Medical Journal,2009,37:321324)

　　采用体外细胞生物法来检测自身免疫性甲状腺疾病(autoimmune thyroid diseases,AITD)患者体内的促甲状腺激素受体抗体(TSH receptor antibodies,TRAb)时，需要应用表达人促甲状腺激素受体(human thyroid stimulating hormone receptor,hTSHR)的细胞株。国内目前尚没有此类细胞株供应，鉴于此，本课题组尝试进行了这方面的研究，前期在构建pcDNA3.1hTSHR重组真核表达质粒时，通过DNA测序发现目的基因hTSHR cDNA序列上第256位碱基发生了突变，因此本实验拟采用环状诱变PCR法对该碱基进行诱变，以期获得序列完全正确的重组真核表达质粒。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　MutadirectTM定点突变试剂盒购自北京赛百盛生物工程公司，DH5α感受态细胞、DNA分子质量标准及质粒抽提纯化试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，pcDNA3.1hTSHR(-256 C)重组真核表达载体为本课题组前期所构建，限制性内切酶KpnⅠ和XbaⅠ为日本TaKaRa公司产品，胰蛋白胨、酵母提取物为英国Oxoid公司产品，引物由上海生工生物工程技术有限公司合成，其余为国产分析纯。

　　1.2 引物设计

　　基本原则：上、下游引物互补，延伸方向相反，均携带突变位点，且确保突变位点在引物的中央位置;长度为25～45 bp，最好30～35 bp;退火温度不低于78 ℃;GC含量大于40%;最好使用经过纯化的引物。根据上述原则，采用Muta Primer软件得到如下引物(下划线字母为突变碱基)：上游引物，5′CTA CGT ATC TAT AGA TGT GAC TCT GCA GCA GCT GG3′;下游引物,5′CCA GCT GCT GCA GAG TCA CAT CTA TAG ATA CGT AG3′。

　　1.3 PCR扩增反应

　　反应体系为50 μl，按次序加入10×反应缓冲液5 μl，质粒DNA模板2 μl(约20 ng)，上、下游引物(10 pmol•μl-1)各1 μl，dNTP mix(2.5 mmol•L-1)2 μl，ddH2O 38 μl，MutadirectTM DNA聚合酶1 μl。反应条件：95 ℃预变性30 s;然后95 ℃变性30 s，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸9 min，共15个循环;最后72 ℃保温10 min。扩增反应完成后将产物冰浴5 min，然后置于室温。

　　1.4 模板质粒的去除

　　在上述PCR反应产物中加入1 μl MutazymeTM酶(10 U•μl-1)于37 ℃温育1.2 h，以除去模板质粒。该步骤的原理是MutazymeTM酶能降解甲基化或半甲基化的模板质粒DNA，而PCR扩增的新质粒DNA没有甲基化，因此不会被降解，从而净化了突变的双链DNA。

　　1.5 转化

　　将10 μl上述经酶切处理过的PCR产物加入到100 μl DH5α感受态细胞悬液中，混匀后冰浴30 min，42 ℃热休克90 s后立即冰浴2 min，加入900 μl不含抗生素的无菌LB培养液，37 ℃振荡培养45 min(150 r•min-1)。取100 μl转化后的菌液均匀涂布于含100 μg•ml-1氨苄青霉素的LB固体琼脂平板上，37 ℃培养16 h。挑取单克隆菌落并接种到5 ml含100 μg•ml-1氨苄青霉素的LB培养液中，37 ℃振荡培养16 h(250 r•min-1)。按质粒抽提试剂盒说明书提取质粒。

　　1.6 鉴定

　　将扩增后的菌液送上海生工生物工程技术有限公司，对目的基因的全部碱基序列进行测定，并采用Blast比对软件进行鉴定。用限制性内切酶KpnⅠ和XbaⅠ双酶切突变后的重组质粒，1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

　　2 结 果

　　2.1 重组点突变质粒的酶切鉴定

　　克隆到pcDNA3.1中的hTSHR cDNA片段长度约为2.3 kb，pcDNA3.1的片段长度约为5.5 kb。所提取的突变后重组质粒经KpnⅠ和XbaⅠ双酶切后，在1%琼脂糖凝胶电泳上可见相应的两条特异性目的条带(图1)，片段长度与预期相符，表明所挑取的单克隆菌落中的确携带有所需要的质粒，接下来通过测序进一步证明定点突变是否成功。

　　2.2 DNA测序结果

　　诱变前及诱变后目的基因的部分测序结果见图2及图3(图2中箭头所指为待诱变的碱基，图3中箭头所指为成功诱变后的碱基)。结果表明，插入到pcDNA3.1中的hTSHR cDNA序列中第259位碱基已由C突变回正常的G，即第87位氨基酸残基由亮氨酸突变回缬氨酸，而目的基因其他部位的碱基序列均未发生随机突变。

　　3 讨 论

　　hTSHR是引起AITD最重要的靶抗原之一[1]，TRAb是针对hTSHR所产生的一类异质性抗体。检测TRAb对于AITD的诊断、疗效的评估及预后的判断等方面具有重要的临床意义[2]。目前较为成熟的TRAb检测方法主要有受体分析法和体外细胞生物分析法[3]，后者需要应用到能够稳定表达hTSHR的细胞株，鉴于国内目前尚没有此类细胞株供应，本课题组尝试进行了这方面的研究。前期在构建pcDNA3.1hTSHR图2 诱变前目的基因测序结果(部分)

　　图3 诱变后目的基因测序结果(部分)

　　重组真核表达质粒时，通过DNA测序并比对后发现所插入的目的基因片段hTSHR cDNA序列中第259位碱基由正常的G突变为C，导致第87位氨基酸由缬氨酸突变为亮氨酸。考虑到该位点突变可能会影响所表达的蛋白质的功能，因此需要采用定点诱变技术将突变的碱基诱变回正常的碱基。

　　定点诱变技术是分子生物学中常用的实验方法，通过有目的地改变DNA序列中的碱基，从而满足不同研究者的应用需求。现有的方法主要包括化学诱变、寡核苷酸介导的诱变、盒式诱变和基于PCR的诱变[4]等。其中基于PCR的定点诱变技术包括重叠延伸PCR、大引物PCR及环状诱变PCR等，这类诱变方法因其突变效率高、操作简便等优点而备受青睐，但也各有不足之处，需根据具体情况选用最适宜的方法[5]。重叠延伸PCR法应用范围非常广泛，突变成功率很高，但步骤较为繁琐，一次突变需设计2对引物，进行3次PCR反应，通常还需对中间产物进行纯化。大引物PCR法需要设计1对侧引物及1个诱变引物，进行2次PCR反应，步骤较重叠延伸PCR相对简便，但突变效率略低。而环状诱变PCR法只需设计1对含预期突变的互补的诱变引物，以环状质粒为模板进行1次PCR扩增，得到含预期突变的带缺口的环状质粒，然后用Dpn Ⅰ酶降解甲基化或半甲基化的模板质粒后，直接将PCR产物转化到感受态细胞内进行缺口修复和克隆。此方法与前两种相比更为简便快捷，无需进行亚克隆及产物纯化等繁琐的步骤，因此当待突变的基因已经克隆到环状质粒时，可优先选用环状诱变PCR法。国内已有学者采用此类方法成功实现了定点诱变[67]。

　　鉴于上述诱变方法的比较，本研究选用了环状定点诱变技术，成功实现了预期位点的单碱基定点诱变，而且在目的基因其他部位的碱基序列均未出现随机突变，从而获得了序列完全正确的pcDNA3.1hTSHR重组真核表达质粒，为后续研究奠定了基础。

　　环状定点诱变技术是一种高效、简便、快捷的定点诱变方法，但也存在一定的局限性，如：应用范围主要针对环状DNA，PCR扩增的产物有时会出现一些非预期突变，尤其当环状质粒长度较大时。因此该技术对DNA聚合酶的保真性、引物的设计及纯度要求很高，PCR反应的循环参数需精确调节，而且要求模板质粒绝大多数为超螺旋的。

　　【参考文献】

　　[1]Chistiakov D A.Thyroidstimulating hormone receptor and its role in Graves’ disease[J].Mol Genet Metab,2003,80(4):377388.

　　[2]兰玲,施秉银.促甲状腺素受体抗体检测的临床意义[J].国外医学内分泌学分册,2005,25(1):4244.

　　[3]Cho B Y.Clinical applications of TSH receptor antibodies in thyroid diseases[J].J Korean Med Sci,2002,17:293301.

　　[4]萨姆布鲁克 J,拉塞尔 D W.分子克隆实验指南[M].黄培堂,汪嘉玺,朱厚础,等译.3版.北京:科学出版社,2002:10951096.

　　[5]罗师平,冷希岗.基于PCR的体外诱变技术[J].国外医学生物医学工程分册,2005,28(3)：188.

　　[6]刘玉冰,李晓霞,王宝利,等.一步PCR法在单碱基定点诱变中的应用[J].天津医科大学学报,2007,13(1):9899.

　　[7]蔡阳林,龙跃生,石奕武,等.GEFS+致病相关基因SCN1A表达载体的定点诱变[J].广州医学院学报,2007,35(2):6264.