浙江汉族人群线粒体DNA ND1基因G3316A突变与2型糖尿病

　　作者：郦卫星,华燕吟,吕建新　　作者单位：1.浙江省人民医院 检验中心，浙江 杭州 310014;2.浙江省人民医院 内分泌科，浙江 杭州 310014;3.温州医学院 检验医学院，浙江省医学遗传学重点实验室，浙江 温州

　　【摘要】 目的 ：研究与日本人2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)相关的线粒体DNA(mitochondria DNA，mtDNA)ND1基因G3316A突变在浙江汉族T2DM人群中的发生率及其临床意义。方法：采用PCR产物直接测序法对浙江籍汉族人群中无血缘关系的315名T2DM患者及158名正常对照的外周血mtDNA进行检测，并用DNASTAR和Antheprot 5.0软件分析突变位点。结果 ：在T2DM患者中检测到6例(占1.90%)G3316A突变，对照组中发现3例(占1.90%)突变，突变发生率在两组间差异无显著性(P >0.05)。携带G3316A位点突变的T2DM组与无该突变的T2DM组之间的临床特点(发病年龄、体重指数和血糖水平等)比较差异亦无显著性。蛋白二级结构中α-螺旋、β-折叠、β-转角和不规则卷曲的构成比没有发生改变。结论：线粒体DNA ND1基因G3316A突变可能与浙江汉族人群T2DM的发生无关，仅为人群中的基因多态性。

　　【关键词】 糖尿病,2型,线粒体DNA;突变;多态性

　　Abstract: Objective: To study the frequency and the clinical significance of mutation mitochondria DNA (mtDNA) NADH dehydrogenase subunit 1 (ND1) gene point G3316A associated with Japanese type 2 diabetes mellitus (T2DM) in Chinese Han Nationaliyt population in Zhejiang province. Methods:Direct sequencing of PCR products was applied to study G3316A mutation in blood corpuscle mtDNA in 315 T2DM patients without relation of consenouinity and 158 normal controls from Zhejiang province. The mutation was analyzed with DNASTAR and Antheprot 5.0 softwares. Results:G3316A mutation was found in 6 (1.90%) of 315 cases with T2DM and 3 (1.90%) of 158 healthy controls，Therefore，the frequency of the mutation had no different between patients and controls (P >0.05). Moreover， clinical characteristics，such as age of onset of diabetes， BMI， and blood sugar levels were not different between T2DM patients with the G3316A mutation and those without it. The proportion of α-Helix，β-Sheet，β-Turn and Coil in the ND1 protein secondary structure did not change. Conclusion: G3316A mutation was a gene polymorphism of mtDNA and unrelated to the pathogenesis of T2DM in Zhejiang Han population.

　　Key words: diabetes mellitus，type 2;mitochondrial DNA;mutation;polymorphism

　　分子遗传学研究表明，某些2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)的发生与线粒体基因(mitochondria DNA，mtDNA)突变有关，因此mtDNA突变型糖尿病逐渐引起人们的重视。目前，已经有许多学者对不同种族及不同地区的T2DM患者进行mtDNA相关性研究，发现某些mtDNA点突变在不同地区T2DM患者中的发生率不同，与该病的发病关系也不尽相同，可能与其发病相关，也可能仅为正常的多态性。为了解国内外学者广为关注的mtDNA G3316A突变与浙江汉族人群T2DM发病之间的关系，我们进行了以下研究。

　　1 对象和方法

　　1.1 对象 病例组为随机选取浙江籍汉族人，根据1997年WHO糖尿病诊断标准确诊为T2DM的住院患者315例，男166例，女149例，年龄(55.6±12.5)岁，患者间无血缘关系;正常对照组为年龄匹配的健康体检者158名，男85例，女73例，均为浙江籍汉族人，无高血压、高脂血症、脑血管病、糖尿病及家族史等。两组间年龄、性别和体重指数差异无显著性(均P>0.05)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 主要仪器和试剂：①试剂：DNA Extrac-tion试剂盒、高保真Taq DNA Polymerase和DNA Purification试剂，均购自TaKaRa公司(Japan);测序试剂盒购自Beckman公司(USA)。②仪器：BECKMAN COULTER CEQ8800测序仪(Beckman公司，USA)，MyCycler Thermal Cycler 170-9703 PCR扩增仪(BIO-RAD公司，USA)。

　　1.2.2 PCR扩增和测序：用DNA Extraction试剂盒提取外周血细胞DNA。PCR扩增上游引物为5’-TTCACAAAGCGCCTTCCCCC-3’，下游引物为5’-GCGATGGTGAGAGCTAAGGTC-3’。由上海生工公司合成(PAGE级纯化，纯度≥99%)。PCR循环参数：94 ℃预变性5 min，95 ℃变性1 min，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共35个循环，72 ℃再延伸5 min。扩增产物长399 bp，用1.5%琼脂糖凝胶电泳检查PCR扩增片段。将上述PCR产物用TaKaRa DNA Purification 试剂盒纯化后，用BECKMAN COULTER CEQ8800测序仪直接测序，机器自动记录测序结果。用DNASTAR软件包进行序列分析，与标准序列比对。若发现有G3316A突变的标本则同时进行反向测序，两者结果相吻合则证明突变结果可靠。

　　1.3 统计学处理方法 计量资料采用t检验;计数资料采用x2检验及Fisher精确概率法。

　　2 结果

　　2.1 DNA测序结果 对所有标本PCR产物纯化后直接测序，有G3316A突变的标本进行反向测序验证，证明所有G3316A突变结果可靠。测序结果如图1。

　　2.2 G3316A基因突变的分布：在315例T2DM组中共检出6例G3316A突变，突变率为1.90%;158例健康对照组有3例突变，突变率为1.90%，G3316A突变率在两组之间差异无显著性(P >0.05)。

　　2.3 临床资料比较 T2DM患者分为G3316A突变阳性组和G3316A突变阴性组，两组比较结果见表1。两组之间发病年龄、家族史、平均体重指数(BMI)以及主要的生化指标糖化血红蛋白(HbA1C)、空腹血糖(FBG)、餐后2小时血糖(P2BG)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)等的差异均无显著性(均P >0.05)。

　　2.4 采用Antheprot 5.0软件中的Gibrat和Predator方法预测野生型和突变后的ND1基因编码的蛋白质二级结构表明，G3316A基因突变后，α-螺旋、β-折叠、β-转角和不规则卷曲在蛋白质中的构成比并没有发生改变，说明该突变对蛋白质二级结构影响不大。结果如表2所示。

　　3 讨论

　　mtDNA缺陷与人类的很多疾病相关[1-2]，如癌症、糖尿病、心脏疾病、神经退行性病变、自身老化等[3-4]。mtDNA突变一方面影响线粒体的呼吸链活性，氧化磷酸化受抑制，ATP产生减少，引发三羧酸循环障碍，导致胰岛素分泌不足;另一方面导致β细胞凋亡。胰岛素分泌不足和β细胞凋亡是T2DM发病的主要原因，因此无论通过哪一方面发挥作用，线粒体基因突变与T2DM发病均有重要联系。随着对线粒体疾病的研究深入，研究者发现，至少20种线粒体基因突变[5-7]与糖尿病有关。1997年美国糖尿病协会提出的糖尿病诊断标准已正式把线粒体基因缺陷型糖尿病列为特殊类型糖尿病，属于β细胞功能遗传缺陷的特殊类型糖尿病。

　　尽管线粒体基因突变与糖尿病的关系在国内外已进行大量研究，但迄今为止，国内外唯一公认的致糖尿病的线粒体点突变是位于tRNALeu (UUR)基因的A3243G突变，在不同种族的T2DM患者中的发生率为0.5%～3.0%[5，8]。1995年Nakagawa等[9]首先报道线粒体基因G3316A突变与日本T2DM发生有关。随后，国内外多名学者对此位点进行了研究，但研究结果不尽相同，可能与研究对象的选择、种族差异以及mtDNA突变异质性等因素有关，不同地区和不同种族由于遗传背景和生活环境的不同，导致研究结果的差异。我们对T2DM患者和正常对照者进行该突变检测，在315例患者中检出突变者6例(占1.90%)，这与国内外报道的2%～4%的突变率基本一致，但在158名正常对照者中也检出3例突变(占1.90%)，两组之间的差异无显著性(P >0.05)。

　　文献报道mtDNA突变糖尿病的临床特点是：有糖尿病家族史且为母系遗传，糖尿病发病早，无肥胖或消瘦，胰岛β细胞功能减退等。在本研究中我们没有发现G3316A突变可影响到患者的平均发病年龄、体重指数及另外一些临床特征，糖尿病家族史的分布也和无此突变的T2DM患者无异。此外，我们对ND1蛋白野生型和G3316A突变后ND1蛋白二级结构的预测表明，该突变并没有引起蛋白构成中α-螺旋、β-折叠、β-转角和不规则卷曲的比例发生改变。综合以上分析，我们认为浙江汉族人群中mtDNA ND1基因G3316A突变可能只是基因的正常多态，而非致病性突变。

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