hURAT1基因真核表达重组体的构建及意义

　　作者：王瑶,韩琳,李长贵　　作者单位：青岛大学医学院附属医院内分泌科，山东 青岛 266003

　　【摘要】目的构建pcDNA3.1(-)/hURAT1真核表达重组体。方法 提取人全血基因组DNA，进行PCR扩增，将纯化的扩增产物与表达载体pcDNA3.1(-)连接后转化DH5α感受态细胞。重组质粒经BamHⅠ和EcoRⅠ酶切后，应用核苷酸序列测定方法进行鉴定。结果PCR扩增得到hURAT1第2外显子至第5内含子长1 958 bp的基因片段。该片段与表达载体pcDNA3.1(-)连接后转化DH5α感受态细胞。重组质粒经酶切和核苷酸序列测定方法鉴定，证实hURAT1片段插入序列和方向正确。结论 hURAT1基因组DNA片段插入真核表达载体pcDNA3.1(-)的序列和方向正确，可用于后续基因功能研究，尤其是编码序列和内含子序列变异的功能研究。

　　【关键词】 人尿酸盐转运子1,pcDNA3.1(-);基因;克隆，分子;内含子;高尿酸血症

　　[ABSTRACT] Objective To construct the recombinant eukaryotic expression vector pcDNA3.1(-)/hURAT1. MethodsTotal genome DNA was prepared from normal human total blood. DNA was then subjected to PCR amplification. PCR product was cloned into pcDNA3.1(-) and then the recombinant vector transformed into DH5α Ecoli. Constructed pcDNA3.1(-)/hURAT1 was identified by restricting enzyme digestion analysis and DNA sequencing. Results A 1 958 bp fragment, including exon 2 to intron 5 of hURAT1 genome DNA, was obtained by PCR amplification. BamHⅠ and EcoRⅠrestriction enzyme digestion and DNA sequencing confirmed with the correct sequence and direction. The pcDNA3.1(-)/hURAT1 had been successfully constructed. Conclusion The fragment of hURAT1 with correct sequence and direction is cloned into the eukaryotic expression vector pcDNA3.1(-), and it can be applied to gene function research in the future, especially to the mutation function research in the CDS or intron.

　　[KEY WORDS] hURAT1; pcDNA3.1(-); Gene; Cloning, molecular; Introns; Hyperuricemia

　　人尿酸盐转运子1(hURAT1)是维持血尿酸水平的关键离子通道，是原发性高尿酸血症和痛风的重要候选基因，其基因变异与原发性高尿酸血症和痛风发病密切相关[1]。其基因位于11q13，含有10个外显子和9个内含子，cDNA 全长2 642 bp，编码区长1 659 bp，编码555个氨基酸[2]。Pubmed SNP检索结果显示，大多数SNP位点位于第2外显子与第5内含子之间，共78个，其中相当数量SNP位点位于内含子区域，而且与尿酸代谢异常高度相关[2～5]。然而，国内外相关研究均为关联性研究和基因编码序列的功能研究,缺乏内含子功能研究。hURAT1 mRNA主要在人肾小管上皮细胞中特异性表达，临床上得到含有待研究SNP位点肾脏标本的概率很小，所以体外重组体的构建及其在真核细胞中的表达成为研究hURAT1基因突变或SNP影响基因转录或翻译的主要手段。本文应用PCR方法对hURAT1第2外显子至第5内含子之间基因组DNA序列进行扩增，然后克隆到真核表达载体pcDNA3.1(-)，构建pcDNA3.1(-)/hURAT1重组体，为今后研究该基因变异对表达的影响奠定基础，从而可以进一步解释hURAT1与尿酸代谢异常之间的关系。

　　1 材料与方法

　　1.1 主要试剂和仪器

　　基因组DNA提取试剂盒(TAKARA公司)、KOD DNA聚合酶(TOYABO公司)、QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN公司)、pGEMT Easy Vector(PROMEGA公司)、T4 DNA 连接酶(PROMEGA公司)、胰蛋白胨(SANGON公司)、酵母提取物(SANGON公司)、琼脂(SANGON公司)、氨苄青霉素(SANGON公司)、限制性内切酶(FERMENTAS公司)、pcDNA3.1(-) Vector(INVITROGEN公司)、DH5α感受态细胞(TIANGEN公司)、质粒小规模抽提试剂盒(AXYGEN公司)、质粒中规模抽提试剂盒(QIAGEN公司)。PTC225型高通量PCR仪(MJR公司)、UVP凝胶成像仪(BIORAD公司)、MIR 262 恒温孵箱(SANYO公司)、低温离心机(EPPENDORF公司)、BioRAD 电泳仪(BIORAD公司)、DU650型紫外线分光光度计(EPPENDORF公司)、超净工作台(Class Biological Safety Cabinet Ⅱ，BAKER公司)。

　　1.2 PCR扩增

　　按照基因组DNA提取试剂盒说明提取正常人全血DNA。以Gene Bank公布的hURAT1基因组DNA序列为模板，并根据所要构建的表达载体要求在5′和3′端引入BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点，扩增包含第2外显子至第5内含子在内的一段序列。所有引物由上海生工生物技术有限责任公司合成(见表1)。应用多重PCR方法，首先扩增片段①，使用1FBAMH和1R作为引物，扩增条件：94 ℃预变性5 min;94 ℃变性 40 s，66 ℃退火 40 s，68 ℃延伸1 min30 s，35个循环;68 ℃终延伸 10 min。其次扩增片段②，使用2F和2RECOR引物，扩增条件：94 ℃预变性 5 min;94 ℃变性 40 s，68 ℃退火 40 s，68 ℃延伸 50 s，35 个循环;68 ℃终延伸 10 min。最终以片段①和片段②PCR产物1∶1混合为模板，扩增目的片段，使用1FBAMH和2RECOR引物，扩增条件：94 ℃预变性 5 min;94 ℃变性 40 s，64 ℃退火 1 min 10 s，68 ℃延伸 2 min，35个循环;68 ℃终延伸10 min。琼脂糖凝胶电泳，紫外线凝胶检测仪检测结果。PCR产物用DNA纯化试剂盒进行回收，定量，分装，一20 ℃贮存。表1 PCR扩增hURAT1基因组DNA片段引物引物名称引物序列

　　1.3 重组体的构建

　　1.3.1 pGEMT Easy Vector/ hURAT1重组体的构建 ①连接：将末端加入dATP的扩增片段与pGEMT Easy Vector按照摩尔比 3～8∶1 于 4 ℃下连接 12 h。②转化：将上述连接反应产物 5 μL加入50 μL的DH5α感受态菌液中，轻轻混匀，冰浴5～30 min;42 ℃热休克 30 s。立即置冰浴中，加入2×YT培养基900 μL，然后37 ℃水平振摇培养45 min(150 r/min);取适量的上述转化菌液涂布于预热的2×YT培养板(含氨苄青霉素100 mg/L);37 ℃水平培养过夜。③筛选克隆：选取一些独立的转化菌落进行小规模培养，用挑菌环挑取单菌落于4 mL含氨苄青霉素(100 mg/L)的2×YT液体培养基中，于37 ℃、250 r/min 振摇培养过夜。以质粒提取试剂盒从4 mL 菌液提取质粒。④重组体鉴定：以限制性内切酶 EcoRⅠ酶切提取的质粒，琼脂糖凝胶电泳，紫外线凝胶检测仪检测结果。

　　1.3.2 pcDNA3.1(-)/ hURAT1重组体的构建①酶切反应：将pcDNA3.1(-)和酶切鉴定正确的pGEMT Easy Vector/ hURAT1重组体均采用BamHⅠ和EcoRⅠ酶双切，回收pcDNA3.1(-)和hURAT1片段，割胶纯化定量。②连接：采用T4 DNA连接酶将pcDNA3.1(-)片段与hURAT1片段按照摩尔比3～8∶1 于16 ℃下连接过夜。③转化。④筛选克隆。⑤重组体鉴定：首先以限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切提取的质粒进行琼脂糖凝胶电泳，紫外线凝胶检测仪检测结果;其次将酶切鉴定正确的质粒进行测序鉴定。

　　2 结果

　　2.1 目的基因hURAT1的PCR扩增产物

　　以hURAT1基因组DNA为模板，采用设计的上游引物和下游引物通过KOD DNA聚合酶扩增片段，将扩增产物在15 g/L琼脂糖凝胶中进行电泳，片段①可见一条长为1 354 bp的条带，片段②可见一条长为604 bp的条带，最终目的片段是一条长为1 958 bp的条带，所有条带大小均与预期相符，未发现非特异扩增条带。

　　2.2 重组体的构建及鉴定

　　2.2.1 重组体的酶切鉴定 割胶回收的hURAT1 DNA片段插入载体pcDNA3.1(-)，转化DH5α菌株。经氨苄青霉素平板筛选后，选取菌落，摇菌，提取质粒。BamHⅠ与EcoRⅠ双酶切鉴定阳性克隆株结果显示，pcDNA3.1(-)/ hURAT1重组体有长5 203 bp 和 1 949 bp 两条带，证明了重组质粒大小及插入方向是正确的。见图3。

　　2.2.2 重组体的测序鉴定 将重组载体测序鉴定，结果表明插入片段hURAT1基因的序列和方向均正确，符合pcDNA3.1(-)载体的读码框架，证明目的基因已成功转入pcDNA3.1(-)载体中。

　　3 讨 论

　　痛风是一组与遗传有关的由于嘌呤代谢紊乱和(或)尿酸排泄障碍所致的异质性疾病，其临床特点为反复发作的急性关节炎，可表现为痛风石、关节强直或畸形、肾实质损害、尿路结石、高尿酸血症等多种慢性症状。高尿酸血症既是痛风的早期阶段，也是痛风发生、发展的必备条件，阐明原发性高尿酸血症的分子机制对预防和治疗痛风有重要意义。目前研究结果显示，原发性高尿酸血症的发病主要是肾脏对尿酸的排泄减少所致，其中发挥主要作用的是肾小管对尿酸的重吸收增加。在多个近曲肾小管上皮细胞膜上的尿酸转运离子通道中，hURAT1为阴离子交换通道，由12个跨膜结构域组成，该通道通过与乳酸等有机阴离子及氯等无机离子交换，将肾小管管腔内的尿酸等转运入肾小管上皮细胞内。hURAT1是维持血尿酸水平的关键离子通道，其活性异常直接影响血尿酸水平[6]。

　　本文PCR扩增hURAT1基因组DNA第2外显子至第5内含子序列后，连接到pcDNA3.1(-)载体中，构建了hURAT1真核表达重组体。该段插入序列中存在SNP位点，其中多个已报道与原发性高尿酸血症和痛风密切相关。GRAESSLER等[3]对389例高尿酸血症病人和263例健康对照者研究显示，hURAT1基因第2外显子C426T多态性与德国人群肾尿酸排泄减少和高尿酸血症显著相关，相对于CC基因型，CT和TT基因型个体肾脏尿酸排泄分数(FEUA)明显降低，血尿酸水平明显升高; J VA’ZQUEZMELLADO等[4]对69例墨西哥原发性痛风病人及其29名一级家属和120名健康个体的hURAT1基因进行序列分析，结果显示，在69例痛风病人中16例存在hURAT1基因突变，占23%，其中 5 种突变位于第5外显子，1 种突变位于第4外显子，16例突变病人中有11例为第5外显子的 C850G 错义突变，提示上述突变可能与原发性痛风有关。尽管hURAT1基因变异与原发性高尿酸血症和痛风的相关性研究取得了较大进展，但仍缺乏功能研究报道,不能说明hURAT1基因突变或SNP是致病位点还是遗传标记,要对其作出因果判断，必须研究hURAT1基因突变或SNP是否影响hURAT1基因表达或蛋白功能。由于hURAT1基因特异表达于人肾小管上皮细胞，体内功能研究较难开展，而本文构建的重组体即可应用定点突变技术特定改变位点碱基，并通过在真核细胞中进一步表达，模拟体内环境，达到研究hURAT1基因变异对尿酸代谢影响机制的目的。

　　此外，本文构建的hURAT1真核表达重组体不但包含基因的编码序列，也包含了其中的内含子序列，从而可用于研究hURAT1基因内含子区基因突变，或SNP以及与内含子特异结合的调控元件对基因转录或翻译的影响机制。作为数倍于外显子的内含子，在生物进化过程中也发挥重要作用，主要参与mRNA剪接、出核孔、转录调控以及翻译过程[7]。据相关文献报道，hURAT1基因内含子区也存在与原发性高尿酸血症和痛风病人相关SNP位点，SHIMA等[5]对326例日本人hURAT1 内含子G/T多态(GG，GT和TT)分析表明，男性受试者中不同基因型者血尿酸水平明显不同， GG 基因型者血尿酸水平最高，GT基因型者次之，TT基因型者最低，提出在日本人群中，该SNP位点可作为独立的高尿酸血症预测标记。本文构建的重组体虽然只包含目的基因的部分基因组序列，但插入序列位于pcDNA3.1(-)载体的pCMV启动区域和SV40多聚A尾之间，仍然可以进一步在真核细胞中进行转录表达[8]，从而弥补了目前hURAT1体外内含子功能研究的不足。

　　综上所述，本文所构建的hURAT1真核表达重组体经酶切、测序鉴定，证明hURAT1基因组DNA片段插入序列和方向正确，可用于hURAT1基因体外功能研究，尤其是内含子的功能研究，是目前探讨hURAT1异常引起的原发性高尿酸血症和痛风的重要工具。

　　【参考文献】

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　　[3]JUERGEN G, ANETT G, SUSETTE U, et al. Association of the human urate transporter 1 with reduced renal uric acid excretion and hyperuricemia in a german caucasian population[J]. Arthritis Rheum, 2006,54:292300.

　　[4]J VA’ZQUEZMELLADO, A L JIME’NEZVACA S, CUEVASCOVARRUBIAS, et al. Molecular analysis of the SLC22A12 (URAT1) gene in patients with primary gout[J]. Rheumatology, 2007,46:215219.

　　[5]SHIMA Y, TERUYA K, OHTA H. Association between intronic SNP in urateanion exchanger gene, SLC22A12,and serum uric acid levels in Japanese[J]. Life Sci, 2006,23:22347.

　　[6]王颜刚,闫胜利,苗志敏. 高尿酸血症及痛风中西医结合研究进展[J]. 青岛大学医学院学报, 2006,42(1):9394.

　　[7]HIR H L, NOTT A, MOORE M J, et al. How introns influence and enhance eukaryotic gene expression[J]. Trends in Biochemical, Science, 2003,28:215220.

　　[8]HIDEKI Y, MASAMITSU N, MIKIYA M, et al. A 5′splice site mutation in the cytochrome P450 steroid 17ahydroxylase gene in 17ahydroxylase deficiency[J]. JCEM, 1997,82,193438.