糖尿病创面难愈机制的研究进展

　　作者：孙晓磊,施森　　作者单位：泸州医学院附属医院血管外科，四川 泸州

　　【摘要】 创面愈合是一个复杂的生物学过程，是炎性细胞、修复细胞、细胞外基质及细胞因子等多因素共同参与并高度协调、相互调控的复杂过程。糖尿病患者皮肤易受损伤，损伤后创面愈合延迟或不愈合，成为临床上亟待解决的难点和热点。近几年来，糖尿病创面难愈机制的研究进展迅速，主要围绕在信号通路、血管生成、神经肽、糖基化终末产物、细胞凋亡及基质金属蛋白酶等方面。本文试就此作一综述。

　　【关键词】 糖尿病,愈合,创面

　　随着世界各国社会经济的发展，居民生活水平的提高，由于饮食结构的改变、日趋紧张的生活节奏以及少动多坐的生活方式等诸多因素，全球糖尿病发病率及患病率增长迅速，糖尿病已经成为继肿瘤、心血管病变之后第三大严重威胁人类健康的慢性疾病。糖尿病患者皮肤易受损伤，损伤后往往反复发作，迁延不愈，形成顽固难愈性溃疡。因此，糖尿病溃疡的治疗是临床急需解决的重要课题之一。随着近年来分子生物学等学科的发展，对糖尿病创面愈合机制的研究也日趋深入，围绕信号通路、血管生成、神经肽、糖基化终末产物、细胞凋亡及基质金属蛋白酶等方面的研究逐渐成为热点。

　　1 信号转导通路

　　创面的愈合需要多种细胞、细胞因子和细胞外基质等因素的共同参与。各因素通过细胞因子相互作用，共同协调，构成一个复杂的生物网络。任何一种细胞因子的缺乏都可能导致创面不愈或愈合延迟。同时，细胞因子与靶细胞受体间信号转导“失耦联”以及多种因子间网络调节“失控”也可能是导致创面不愈的关键因素。

　　1.1 转化生长因子β(TGFβ)与smad信号通路

　　TGFβ有β1～β5五个亚型，哺乳动物体内，TGFβ13是主要的三种，其中又以TGFβ1占大多数。smad蛋白家族是把TGFβ与其受体结合后产生的信号从胞质传导到细胞核内的中介分子，各类smad蛋白相互联系制约，并通过不同途径参与TGFβ的信号转导。

　　TGFβ1可以促进成纤维细胞的迁移、增殖，强烈趋化成纤维细胞和炎性细胞，抑制上皮细胞生长但加速血管形成，可以通过刺激成纤维细胞合成胶原等细胞外基质、抑制基质蛋白酶活性并增强胶原酶抑制剂的表达来调节ECM蛋白的表达，在创面愈合的早期TGFβ1即被释放，伤后5～7 d呈现第二个高峰。伤口愈合过程中内源性Smad3的表达、激活与炎症反应的启动、结束及胶原合成密切相关。

　　糖尿病患者溃疡区TGFβ1正常的伤后上调反应缺失，而TGFβ3却表达上调，可以部分地解释其慢性难愈创面的特点;Chesnoy等[1]通过糖尿病小鼠创面皮内注射质粒DNA来转染TGFβ1基因发现：创面的细胞增殖率和细胞外新生基质的密度、有序性排列比对照组明显提高，且愈合时间可提前约50%。

　　1.2 Ras信号通路

　　Ras信号通路在糖尿病创面愈合延迟或不愈病理机制中扮演着重要的角色，并逐渐成为研究的热点。Ras信号通路包括如下几部分(1)细胞外生长因子与受体偶联;(2)受体二聚化激活;(3)丝裂原活性蛋白激酶(MAPK)级联反应;(4)核内活化蛋白1(AP1)激活;(5)基因的转录和表达。

　　信号转导的复杂网络需要传递信号分子精确的时空排列，当脱离原本正常的细胞环境，许多转信号分子就杂乱的相互作用。初步研究认为高糖抑制Ras信号途径受体和其中的关键激酶Ras、Raf的磷酸化活化[2]，信号分子表达异常，细胞周期停滞于G0、G1期，细胞增殖的乏力可能促发凋亡，增生细胞减少，凋亡细胞增多显然会破坏创面愈合，可能是通路失活的主要原因。

　　1.3 Wnt信号通路

　　Wnt细胞信号转导途径是调控细胞生长、发育和分化的关键途径。在肿瘤的发生、侵袭转移、细胞黏连极性及细胞凋亡等方面成为目前的研究热点。目前已知的Wnt作用机制有两种：规范途径和非规范途径。

　　规范途径: Wnt与受体卷曲蛋白Frz及低密度脂蛋白相关蛋白LRP5/6结合，胞内散乱蛋白Dsh与Frz胞内区结合后被磷酸化激活，抑制丝/苏氨酸激酶GSK3β活性，使得βcatenin不能被磷酸化，不能被泛素蛋白酶体系统降解。不能降解的βcatenin在胞质内大量积累并进入核内，与转录活化因子TCF/LEF结合，启动下游靶基因的表达。无Wnt信号刺激细胞时酪蛋白激酶I(casine kinase，CKI)将细胞质中βcatenin的Ser45磷酸化，磷酸化后的βcatenin与轴蛋白Axin，GSK3β，结肠腺瘤性息肉病基因蛋白APC等形成“破坏复合体”，复合体中的GSK3β相继使βcatenin的Ser41，Thr33，Thr37磷酸化而使βcatenin能被泛素连接酶复合体E3的亚单位βTrCP(Btransducin repeatcontaining proteins)识别，经蛋白酶体途径降解，因而此时细胞内的βcatenin水平较低。

　　非规范途径：Wnt只与Wnt受体复合物的亚基Frz作用，而不需要LRP5/6，包括Wnt/Ca2+通路和平面细胞极性信号通路。

　　既往在肿瘤的研究中发现：βcatenin不仅受经典的Wnt信号调控，而且受前列腺素PGE/EP2信号，表皮生长因子EGF/EGFR/PI3K/AKT，以及钙粘蛋白Ecadherin信号调控，这些分子之间有较为复杂的crosstalk系统[3]。而目前的研究发现：高糖通过PI3KAkt信号途径抑制内皮细胞迁移和增殖及血管发生改变，也能引起黏附分子Ecadherin的上调。ChunLiang Lin等[3]报道，Wnt/βcatenin信号的上调能提高高糖导致的肾系膜细胞的活性;研究表明：Wnt以及βcatenin表达增强，表皮细胞的增殖、分化和迁移能力增强，且创面愈合加快[4，5];皮肤角质化细胞wnt信号途径影响创伤后皮肤的厚度及色素沉着[6];wnt信号途径参与保护高糖导致的血管内皮细胞的损伤[7]。

　　2 血管生成与创面愈合

　　微循环障碍是糖尿病微血管病变的典型改变之一，内皮细胞结构和功能的完整是稳定微循环的关键。Schramm JC等[8]发现血管内皮细胞和血管平滑肌细胞的功能障碍导致血管舒张能力减弱，使糖尿病创面有效血流灌注及物质交换减弱，前列腺素PGE1及高糖参与其中;并且发现伴有代谢综合症发生微血管相关病变的频率明显增高[9]。

　　在机体发生创伤后，创伤部位的新生血管给创伤部位提供氧、营养物质和生物活性蛋白，局部组织的缺血可直接影响创伤愈合的程度及其预后。它与血管内皮细胞因子(VEGF)、血管形成因子1(Ang1)、碱性成纤维细胞因子(bFGF)等细胞因子密切相关，其中VEGF是一种强效的血管生成促进因子，也是最主要的血管生成因子[10]，还具有维持血管的功能。目前，各种促血管生成因子成为临床治疗糖尿病难愈创面的研究热点。

　　3 创面愈合调控的神经因素

　　实验研究表明，神经因素亦参与创面愈合调控的过程。正常皮肤中可表达各种类型的神经肽(neuropeptides)，这些神经肽包括P物质(sP)、生长抑素、神经肽Y(NPY)等等，参与皮肤的诸多生理功能(如代谢、免疫等)和病理变化(最重要的即创伤愈合)。

　　随着神经免疫学的进展，发现神经末梢分泌的感觉神经肽P物质可能是介导机体创伤修复中神经调控的重要物质，是诱导来源于毛囊隆突部和表皮基底层的表皮干细胞(ESCs)向创缘表皮聚集、参与创伤愈合的修复信号因子。ESCs具有强大的多向分化潜能，可以形成皮肤中所有类型的细胞;Bickenbach等[11]应用Brdu/3HTdr双标法标记并连续观察，发现皮肤创伤后，位于毛囊膨大部的ESCs不断增殖并通过不对称分裂分化为TAC(短暂扩充细胞)，后者迁移至创缘，促进创面愈合。但促使ESCs迁移、分化的原因还不清楚。糖尿病皮肤创缘sP浓度远低于正常水平[12]，这可能是由于糖尿病末梢神经病变所致。目前研究发现[13]，在糖尿病大鼠背部皮肤创伤模型上观察到外源性sP可以明显加速糖尿病难愈伤口愈合，提高愈合质量，并且观察到其诱导ESCs向创缘迁移，但其具体机制不清。令人感兴趣的是，最近的研究提示Wnt信号通路参与皮肤发育和再生修复过程，并在表皮干细胞增殖[14]分化过程中起重要的调控作用，我们不知道其中是否存在相关性。

　　另外，在伤口愈合过程中感觉神经肽sP可以促进修复细胞DNA合成以及创面肌成纤维细胞的增生，且能促进肌成纤维细胞增生和新生血管形成，这可能是其促进伤口加速收缩和愈合的机制之一。

　　因此，神经肽通过启动神经源性炎症反应、诱导趋化ESCs、促进伤口收缩及血管新生，参与糖尿病创面愈合的调控过程。

　　4 糖基化终末产物相关学说

　　晚期糖基化终末产物(AGEs)一直是近年来糖尿病及其各类并发症的研究热点，在影响创面愈合方面取得了一定的进展。糖尿病患者体内的血糖波动、胰岛素敏感性降低等都可以使非酶促糖基化反应加速、AGEs 水平升高，干扰内皮细胞与白细胞间的相互作用，还能使单核巨噬细胞功能受抑，分泌细胞因子的能力下降，且在创面浸润的时间延长[15];内皮细胞和成纤维细胞都是创面愈合过程中的主要修复细胞，两者膜表面均存在多种AGEs结合蛋白，AGEs还可抑制内皮细胞增殖，并可以诱导其凋亡，而且与作用时间及含量相关[16];糖基化修饰后的碱性成纤维细胞生长因子促有丝分裂的活性明显降低，而且，AGEs还能抑制成纤维细胞合成胶原的能力[17]。

　　5 细胞凋亡与糖尿病难愈性创面

　　细胞凋亡存在于创面愈合的每个阶段，随着研究的深入逐渐成为研究的新方向和热点。Bcl2与bax是一对正负凋亡调节基因，前者抑制细胞凋亡，后者不仅本身能诱导细胞的凋亡，而且可以与前者一起调控细胞的凋亡。

　　糖尿病慢性溃疡创面观察显示，与正常糖尿病患者皮肤相比，溃疡创面凋亡阳性细胞数量均明显增多。在正常细胞到溃疡组织，bcl2含量逐渐下降而bax蛋白的表达呈增高趋势。难愈性创面的迁延不愈不仅仅和bcl基因家族的表达有关[18]，同时还与营养、血供、细胞因子等其他因素有关：糖尿病难愈创面组织中抑癌基因p53的表达增强，下调bcl2基因的表达和上调bax基因的表达，从而增加细胞的凋亡率;糖尿病患者血中氧自由基含量明显增高，使创面组织成纤维细胞bcl2的表达下调[19];糖尿病难愈创面组织中高血糖可以诱导bax基因的表达增强;AGEs(糖基化终末产物)可引起氧化因素的高表达，从而引起bcl2基因的表达下调，诱发细胞凋亡的发生，创面细胞数目减少，创面难愈[20];某些细胞因子，如IL2、IL4、IL7等可促进炎症细胞bcl2的表达，TNFα通过抑制bcl2基因的表达，来促进凋亡。

　　6 MMPs家族动态平衡与DM难愈性创面修复

　　创伤愈合是个复杂而有序的生物学过程，细胞移行、肉芽组织的形成、新生血管化以及基质的重塑均有赖于细胞外基质(extracellular matrix.ECM)的可控性代谢。ECM的过度沉积或降解将致创面修复异常。

　　基质金属蛋白酶(matrix metaltoproteinases，MMPs)是一类具有共同生化性质的可降解ECM的锌依赖性肽链内切酶，是参与ECM降解的主要蛋白酶之一。MMPs可由皮肤的多种细胞如成纤维细胞，角化细胞，巨噬细胞，内皮细胞，肥大细胞，嗜酸性细胞在特殊信号如细胞因子【肿瘤坏死因子(TNFα)，白细胞介素1β (IL1β)，IL6等】的刺激下产生。按照作用底物可以分为胶原酶，明胶酶，间质溶素，膜型MMP等。蛋白酶的激活的调控有几种机制，包括转录水平，酶原激活和金属蛋白酶组织抑制物(tissue inhibitors of metalloproteases，TIMPs)的调控。

　　慢性溃疡的活检和伤口渗液显示高浓度的前炎症因子、MMPs和低浓度的生长因子，而可愈性伤口则表现为低浓度的前炎症因子，MMPs和高浓度的生长因子[21]。在糖尿病大鼠模型的实验中，未受损皮肤即存在菲薄的连接组织的破坏。而Wall等[22]对糖尿病患者未受损皮肤的观察也提示糖尿病未受损真皮成纤维细胞中MMP-2，MMP-3增高。在糖尿病难愈性创面中还出现MMP1，MMP2，MMP13水平增高的现象[23]，这可能是由于在角质细胞增殖中的MMP1的表达有助于重新上皮形成，而在愈合后期，MMP1在上皮中的过表达阻碍了基膜形成和肉芽组织形成，影响了组织重塑。在Lobmann等[23]的研究中，糖尿病难愈性创面组织中TIMP2蛋白低于对照组3倍，但由于TIMP与年龄相关，故认为MMP/TIMP的比例对反映伤口愈合情况更重要。

　　目前，对于糖尿病难愈性创面与MMPs关系研究的报道尚少见。MMPs在糖尿病患者创伤前后皮肤组织中时空表达异常以及MMPs/TIMP失衡可能是糖尿病创面愈合延迟的重要机制之一。

　　7 小结与展望

　　随着分子生物学、免疫学和遗传学等实验技术手段的不断提高与成熟，影响创面愈合的因素正逐个被发现。这些领域的研究进展为治疗糖尿病难愈性创面提供了更广阔的思路和方式，我们可以期待在不久的将来，临床糖尿病难愈性创面的治疗必将会翻开新的一页，取得更大的进步。

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