p38 MAPK在高糖诱导的肾小管上皮细胞转分化中的作用

　　作者：吕智美,邓华聪,诸葛福媛,刘金波,冯正平　　作者单位：重庆医科大学附属第一医院内分泌科，重庆 400016

　　【摘要】目的: 探讨p38 MAPK在高糖诱导的肾小管上皮细胞转分化中的作用. 方法: 将体外培养的人肾小管上皮细胞(HK2)分为正常对照组(NG), 高糖组(HG), 无关siRNA转染组(RG)、转染p38 MAPK siRNA 24 h组(24hG)、转染p38 MAPK siRNA 48 h组(48hG). 免疫细胞化学法检测α平滑肌肌动蛋白(αSMA)和细胞角蛋白(CK)的表达，RTPCR法检测CK mRNA的表达，Western Blot检测p38 MAPK的活化及αSMA的表达. 结果: p38 MAPK siRNA能显著抑制高糖诱导的p38 MAPK过度活化;高糖刺激后肾小管上皮细胞αSMA蛋白表达明显高于正常组(P<0.05)，而p38 MAPK siRNA转染组其水平显著低于高糖组(P<0.05);高糖诱导HK2细胞CKmRNA和蛋白水平明显降低(P<0.05)，而p38 MAPK siRNA转染后其水平显著高于高糖组(P<0.05);结论: 高糖可导致肾小管上皮细胞p38 MAPK通路的激活而下调CK，同时导致αSMA蛋白的表达，诱导其表型转化.

　　【关键词】 p38 丝裂原活化蛋白激酶类,肾小管,上皮细胞,上皮间质转分化

　　0引言

　　糖尿病肾病(DN)是糖尿病的主要微血管并发症，而肾脏纤维化是糖尿病肾病进展为慢性肾功能衰竭的病理基础. 研究发现，肾小管上皮细胞转分化为间充质细胞(epithelialmesenchymaltransition, EMT)是肾间质纤维化发生机制之一[1]. p38丝裂素激活蛋白激酶(p38 MAPK) 是脊椎动物体内广泛存在的丝氨酸/苏氨酸蛋白调节激酶，在糖尿病肾病的发生和发展中发挥重要作用[2-3]. 我们应用RNA干扰技术(siRNA) 抑制肾小管上皮细胞p38 MAPK基因的表达，观察其对高糖诱导的肾小管上皮细胞转分化的影响，以探讨DN肾间质纤维化的机制，为糖尿病肾病的基因治疗提供实验依据.

　　1材料和方法

　　1.1材料人近端肾小管上皮细胞株2(HK2)(美国ATCC). 鼠抗人αSMA(美国Santa Cruz公司), 鼠抗人CK抗体(北京中杉公司), p38和磷酸化p38(Pp38)抗体(cell signaling公司)，通用型RTPCR试剂盒(日本TaKaRa公司)， LipofectamineTM2000(美国Invitrogen公司).

　　1.2方法

　　1.2.1p38 MAPK siRNA转染人p38特异性siRNA序列：Sense, 5′GAAGCTCTCCAGACCATTT3′; Antisense,5′AAATGGTCTGGAGAGCTTCTT3′. 用Blast搜寻EST基因库，对选中的siRNA序列同源性分析. 将适量HK2细胞接种于培养板，分别转染重组PshRNAp38 MAPK和无关对照质粒，依LipofectamineTM2000转染试剂盒说明书进行操作.

　　1.2.2细胞培养及分组HK2用含100 mL/L FCS的DMEM培养液传代培养. 分为5组：①正常对照组(NG): 培养液中含D葡萄糖(5.5 mmol/L);②高糖组(HG):培养液中含D葡萄糖(30 mmol/L);③无关siRNA转染组(RG):无关pshGSP转染细胞24 h后, 再给予D葡萄糖(30 mmol/L);④转染p38 MAPKsiRNA 24 h组(24hG):pshRNAp38 MAPK转染细胞24 h后，再给予D葡萄糖(30 mmol/L);⑤转染p38 MAPK siRNA 48 h组(48hG):pshRNAp38 MAPK转染细胞48h后，再给予D葡萄糖(30 mmol/L). 每组均加入等量脂质体，给予D葡萄糖作用48 h后收集细胞和培养液用于各项检测. 各组细胞分别用相差显微镜和透射电镜进行观察.

　　1.2.3免疫细胞化学法检测CK和αSMA表达HK2细胞爬片，待细胞长至亚融合状态，以无血清培养基继续培养24 h使其同步化，分组如前述. 根据SP试剂盒所示方法检测CK，αSMA的表达. 生物医学图像分析系统进行图像分析，用平均吸光度表示阳性物质的相对含量.

　　1.2.4RTPCR实验各组按照Trizol说明书提取总RNA，根据260 nm吸光度值计算RNA浓度. 取总RNA 1 μg作逆转录，步骤参照试剂盒说明. CK引物正义链：5′CCCAGAGCCTTGAGATAGAAC3′，反义链:5′CACGACCTTGCCATCCAC3′. βactin引物正义链5′CACCAACTGGGACGACAT3′，反义链:3′GCAACGATAGGTCCGACA5′. 反应参数:变性94℃ 2 min，变性94℃ 30 s，退火55℃ 30 s，延伸72℃ 2 min，35个循环. PCR产物琼脂糖凝胶电泳，CK mRNA表达以βactin作为内参照物调整后进行半定量分析.

　　1.2.5Western Blot检测收集细胞，提取蛋白，考马斯亮蓝法测定蛋白浓度. SDS聚丙烯酰胺凝胶上样，积层胶电压50 V电泳，分离胶60～65 V电压电泳， 50 V转膜2 h， BSA封闭l h，一抗p38，Pp38(1∶1000)或αSMA(1∶200)，βactin(1∶2000)孵育过夜，洗涤后加二抗(1∶2500) 室温反应1 h，曝光、显影. 凝胶成像和化学发光分析系统进行灰度分析.

　　统计学处理：数据用 x±s表示，采用统计学软件SPSS11.0进行统计学处理，多组计量资料经检验方差齐同，采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSDt检验，P<0.05为差异有统计学意义.

　　2结果

　　2.1细胞形态学改变倒置显微镜下，正常HK2细胞为椭圆形贴壁生长. 高糖刺激后，细胞间隙增大，呈梭形，失去鹅卵石样形态. 转染p38 MAPKsiRNA后，部分细胞为椭圆形，部分转变为梭形. 透射电镜下，正常对照组细胞表面微绒毛积聚，细胞内线粒体丰富，粗面内质网少. 高糖组和无关转染组与正常对照组相比，细胞表面微绒毛明显减少，胞质内粗面内质网丰富，线粒体极少. 而转染p38 MAPKsiRNA组与高糖组和无关转染组相比，细胞表面微绒毛增多，细胞内粗面内质网减少，线粒体增多(图1). A:正常对照组; B:高糖组; C:无关siRNA转染组; D:转染p38 MAPKsiRNA 24 h组; E:转染p38 MAPKsiRNA 48 h组.

　　2.2p38 MAPKsiRNA对肾小管上皮细胞p38 MAPK表达的影响Western Blot检测显示，高糖组和无关转染组p38 MAPK被磷酸化激活，与正常对照组相比差异有统计学意义(P<0.05);在p38 MAPKsiRNA转染组，p38 MAPK的磷酸化水平较高糖组和无关转染组明显下调(P<0.05).

　　1:正常对照组; 2:高糖组; 3:无关siRNA转染组; 4:转染p38 MAPKsiRNA 24 h组; 5:转染p38 MAPKsiRNA 48 h组.

　　2.3p38 MAPKsiRNA对肾小管上皮细胞CK和αSMA表达的影响免疫细胞化学结果显示，与正常对照组相比，高糖组和无关转染组CK表达显著降低，差异有统计学意义;p38 MAPKsiRNA转染组，与高糖组和无关转染组相比CK表达显著增加(P<0.05,表1). αSMA免疫细胞化学结果显示，与正常对照组相比，高糖组和无关转染组αSMA表达水平显著增加;p38 MAPKsiRNA转染组与高糖组和无关转染组相比αSMA表达水平显著降低，差异有统计学意义(P<0.05,表1).与正常对照组相比，高糖组和无关转染组CK mRNA扩明显降低，差异有统计学意义. p38 MAPKsiRNA转染后，其水平较高糖组和无关转染组明显增高，差异有统计学意义(P<0.05，图3). 高糖组和无关转染组在43KD可见αSMA蛋白表达，正常对照组未见αSMA表达，差异有统计学意义. 而p38 MAPKsiRNA转染组αSMA蛋白表达水平较高糖组和无关转染组明显降低(P<0.05，图4). 表1各组HK2细胞CK及αSMA蛋白表达的变化

　　3讨论

　　肾脏纤维化是糖尿病肾病(DN)进展为慢性肾衰的病理基础，细胞外基质过度聚积是肾脏纤维化的主要原因. 研究证实，肾小管上皮细胞转分化是肾间质纤维化发生的重要机制之一[4-5]. 深入了解转分化的发生机制，对于早期防治糖尿病肾病具有十分重要的意义.

　　M:marker;1:正常对照组; 2:高糖组; 3:无关siRNA转染组; 4:转染p38 MAPKsiRNA 24 h组; 5:转染p38 MAPKsiRNA 48 h组.

　　1：正常对照组; 2:高糖组; 3:无关siRNA转染组; 4:转染p38 MAPKsiRNA 24 h组; 5:转染p38 MAPKsiRNA 48 h组.

　　αSMA是肌成纤维细胞的标志性蛋白，肌成纤维细胞是活化的成纤维细胞，具有很高的合成细胞外基质的作用，是引起肾间质纤维化的主要原因[6]. 正常情况下，肾小管上皮细胞表达其标志蛋白CK，不表达αSMA. 我们实验发现，高糖可以刺激HK2细胞发生形态学改变，细胞逐渐由卵圆形拉长成梭形，微绒毛明显减少，粗面内质网明显增多;这提示细胞失去了上皮特性而表现为成纤维细胞特性. 同时，正常对照组几乎无αSMA的表达，但高糖作用下αSMA高表达，而HK2的标志蛋白CK的表达明显下调，表明高糖诱导肾小管上皮细胞表型转化，可能是糖尿病肾病肾间质纤维化的重要机制之一.

　　p38 MAPK为信号转导通路的交汇点，在糖尿病肾病的发生发展起到重要的作用[7]. 本实验成功构建pshRNAp38 MAPK表达载体，能有效抑制p38 MAPK的表达. 转染pshRNAp38 MAPK后， p38 MAPK的表达被抑制，HK2细胞αSMA的表达明显低于高糖组和无关转染组，而HK2的标志蛋白CK的表达较高糖组和无关转染组明显增加. 同时形态学检查显示，p38 MAPK siRNA转染组细胞形态介于对照组与高糖组之间，部分细胞为椭圆形，部分转变为梭形，同时细胞表面微绒毛较高糖组明显增多，胞浆内粗面内质网较高糖组减少. 表明高糖可通过p38 MAPK活化诱导肾小管上皮细胞转分化，参与糖尿病肾病的纤维化进程.

　　本研究表明，高糖能够导致肾小管上皮细胞p38 MAPK通路的激活，下调CK表达，同时导致αSMA等间充质细胞表型的表达，诱导其表型转化，而p38 MAPKsiRNA能有效抑制其发生，p38 MAPK作为肾小管上皮细胞转分化中的重要因子，成为糖尿病肾病纤维化干预的中心环节，该研究为应用RNAi糖尿病肾病的基因治疗提供实验依据.

　　【参考文献】

　　[1] Fan L, Sebe A, Peterfi Z, et a1. Cell contactdependent regulation of epithelialmyofibroblast transition via the rhorho kinasephosphomyosin pathway [J]. Mol Biol Cell, 2007, 18(3): 1083-1097.

　　[2] Sakai N, Wada T, Furuichi K, et a1. Involvement of extracellular signalregulated kinase and p38 in human diabetic nephropathy [J]. Am J Kidney Dis, 2005, 45(1): 54-65.

　　[3] Komers R, Lindsley JN, Oyama TT.Renal p38 MAP kinase activity in experimental diabetes [J]. Lab Invest, 2007, 87(6): 548-558.

　　[4] Neil GD, Orfhlaith ES, Declan AH, et al. TGFβ induced EMT can occur independently of its proapoptotic effects and is aided by EGF receptor activation [J]. Am J Physiol Renal Physiol, 2006, 290(5): 1202-1212.

　　[5] White LR, Blanchette JB, Ren L, et al. The characterization of alpha5integrin expression on tubular epithelium during renal injury [J]. Am J Physiol Renal Physiol, 2007, 292(2): 567-576.

　　[6] Faulkner JL,Szcykalski LM,Springer F,et al. Origin of interstitial fibroblasts in an accelerated model of angiotensin IIinduced renal fibrosis [J]. Am J Pathol, 2005, 167(5): 1193-1205.

　　[7] Chen Y, Blom IE, Sa S, et al. CTGF expression in mesangial cells: involvement of SMADs, MAP kinase, and PKC[J]Kidney Int, 2002, 62(4): 1149-1159.