糖基化终产物对人肾系膜细胞趋化因子RANTES表达的影响

　　作者：马丽,孙子林,王少华　　作者单位：1.东南大学附属中大医院 内分泌科，江苏 南京 210009;2.武警南京消防医院 内科，江苏 南京 210008

　　【摘要】目的 探讨糖基化终产物(AGEs)对人肾系膜细胞(HRMC)趋化因子RANTES表达的影响。方法 常规方法制备糖基化终产物(AGEsBSA)，干预体外培养的HRMC，收集培养上清和细胞，ELISA法检测上清中RANTES浓度，实时定量RTPCR检测RANTES mRNA表达水平，Western blot检测RANTES蛋白表达，分别设立同浓度的BSA组及空白对照组作为对照。结果 AGEsBSA干预组HRMC RANTES mRNA和蛋白表达水平及上清中RANTES浓度明显高于对照组，并存在浓度和时间依赖效应。结论 AGEsBSA上调HRMC RANTES表达和分泌，可能参与糖尿病肾病的发生。

　　【关键词】 糖基化终产物,人肾系膜细胞,正常T细胞表达分泌的调节趋化蛋白

　　近年来趋化因子与糖基化终产物(advanced glycosylation end products，AGEs)在介导糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)发病中的作用日渐得到人们的关注[1]，我们前期研究观察到糖尿病患者血清AGEs，尤其是小分子的糖基化终产物肽(AGEspeptides，AGEP)、CC亚族趋化因子——单核细胞趋化蛋白1(monocyte chemoattractant protein1，MCP1)和正常T细胞表达分泌的调节活化蛋白(regulated upon activation，normal T cell expressed and secreted，RANTES)均显著高于正常对照，且与糖尿病肾病发生发展相关[2]。本研究旨在细胞水平观察AGEs对人肾系膜细胞(human renal mesangial cells，HRMC)表达RANTES的影响,为进一步阐明DN的发病机制提供新的理论依据。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 细胞株 人肾系膜细胞(HRMC)株，由阮雄中博士(Renal Unit，Royal Free Hospital，London，UK)惠赠。

　　1.1.2 试剂 牛血清白蛋白(BSA)，DMEM培养基，新生小牛血清，高纯度RNA提取试剂盒和LightCyclerTM Faststart DNA Master SYBR Green Ⅰ试剂盒(德国罗氏)，SuperscriptTM Ⅱ RNase H-逆转录试剂盒(美国Invitrogen)。RANTES及cyclophilin引物由德国Interactiva合成，人RANTES 96孔ELISA试剂盒(法国Immunotech)，RANTES小鼠抗人单克隆抗体IgG(R&D)，Erk小鼠抗人单克隆抗体和辣根过氧化物酶标记兔抗小鼠IgG(美国Santa Cruz 公司)，BCA100蛋白质定量测定试剂盒，PVDF膜(德国罗氏分子生化)，化学发光底物和增强剂(美国Pierce Pico)，X线胶片(柯达)。

　　1.1.3 仪器和器材 CO2恒温培养箱(NAPCO)，LightCycler实时PCR仪(德国罗氏)，SCR300电泳仪(上海万达生物工程公司)，紫外检测仪(天能科技有限公司)，洗板机(Model1575，BIORAD产品)，酶标仪(Model 550，BIORAD产品)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 AGEsBSA的制备 在pH 7.4的 PBS溶液里加入BSA，使浓度为5.0 g•L-1，然后加入葡萄糖使其终浓度为50 mmol•L-1，过滤除菌后37℃无菌孵育。使用前以pH 7.4 PBS溶液透析除去未结合的葡萄糖。对照组BSA中不含葡萄糖，其余条件一致。

　　1.2.2 HRMC的培养 加入含10%小牛血清的DMEM培养液，置于37℃、5%CO2的饱和湿度培养箱中，隔日换液，每3d以1∶2传代1次。

　　1.2.3 HRMC的干预 将处于对数生长期的HRMC移入6孔板中，待细胞长到次融合状态(细胞计数约为2×106)后换用无血清DMEM培养24 h，然后分组干预：(1) 用同一浓度(400 mg•L-1)的AGEBSA干预6、12、24、48 h，以同浓度BSA组作为对照;(2) 以不同浓度(50、100、200、400、800 mg•L-1)的AGEBSA干预HRMC 48 h，以空白对照组作为对照。

　　1.2.4 实时定量RTPCR检测细胞RANTES mRNA的表达 按照试剂盒说明书进行总RNA的提取、cDNA逆转录合成及PCR反应。cyclophilin的引物：上游5′ATGGTCAACCCCACCGTGT3′，下游5′GAC AAGGTCCCAAAGACAGCAG3′，RANTES的引物：上游5′ATGAAGGTCTCCGCGGCACGCCTC3′，下游5′CTAGCTCATCTCCAAAGAGTTGAT3′。 PCR反应条件:95℃ 10 s，60℃ 5 s，72℃ 10 s，共50个循环。实时定量PCR结束后对其融解曲线进行分析。

　　1.2.5 ELISA法检测细胞培养上清中RANTES水平 按照试剂盒说明书进行。

　　1.2.6 Western blot检测RANTES蛋白表达 培养的HRMC经改良的RIPA裂解缓冲液提取。提取物在冰上孵育30 min，4℃ 12 000 r•min-1离心20 min;上清液中的蛋白浓度经BCA法定量。上清液稀释1倍，煮沸5 min。以半干电转移恒流0.8 A•cm2转移30 min。5%PBSTBSA封闭1 h。RANTES小鼠抗人单克隆抗体IgG配成1∶500浓度，4 ℃孵育过夜。PBST缓冲液充分洗膜后膜与1∶2000辣根过氧化物酶标记的兔抗小鼠IgG在室温下摇荡孵育1 h，再次充分洗膜后运用Pierce Pico 化学发光液孵育5 min。X线胶片成像。以Erk作为内参，RANTES条带密度与Erk条带密度的比值作为各组实验数据，每组实验重复3次。

　　1.3 统计学处理

　　数据以x-±s表示，所有数据均使用Prism 3.0统计软件进行单因素方差分析。

　　2 结 果

　　2.1 AGEBSA干预不同时间对HRMC RANTES mRNA、蛋白水平及培养液上清RANTES浓度的影响以400 mg•L-1 AGEBSA对HRMC分别干预6、12、24、48 h，RANTES mRNA、蛋白水平和上清中RANTES浓度均明显高于相应BSA组，呈随时间延长逐步升高趋势。

　　2.2 不同浓度AGEBSA对HRMC RANTES mRNA及蛋白水平影响

　　在基础状态下，HRMC微量表达RANTES mRNA(0.022±0.01)及蛋白(0.11±0.1)，上清中有蛋白[(18.02±8.29) pg•ml-1]分泌。在48h内，随着AGEBSA的干预浓度不断升高(50、100、200、400、800 mg•L-1)，RANTES mRNA水平、蛋白表达及上清中的蛋白分泌呈逐步升高趋势。

　　3 讨 论

　　DN是糖尿病危害性最大的慢性并发症之一，深入研究DN的发病机制进而获取有效的防治措施具有重要意义。目前研究证实，炎症细胞对肾小球的浸润及肾间质的纤维化是DN发生发展中的重要环节。RANTES作为CC趋化因子家族中的一员，在人肾系膜细胞、肾小管上皮细胞和成纤维细胞都有表达,具有较强的趋化炎症细胞的作用。顾晓等[3]研究发现，RANTES对人外周血单个核细胞具有免疫活化作用，可诱导单个核细胞增殖反应。Vielhauer等[4]的研究显示，通过阻断RANTES受体CCR1，可以减少大鼠梗阻性肾病时间质炎症及纤维化的发生。近来文献[5]报道，RANTES及其受体基因的多态性可能与DN密切相关。

　　我们前期研究[6]发现，AGEBSA呈时间依赖方式增加HRMC对RANTES的分泌,且AGEBSA的此种诱导作用启动较慢。本实验在此基础上就AGEs对HRMC RANTES表达和分泌是否存在浓度依赖进行了进一步研究,发现在AGEBSA的作用下，HRMC RANTES mRNA和蛋白的表达及蛋白质分泌呈浓度和时间依赖性地增加。AGEBSA可能通过此途径促使单核和(或)巨噬细胞对肾脏的浸润，从而导致DN的发生。这一途径可能与多种细胞因子途径有关。AGEs受体中研究最多的是RAGE，糖尿病导致AGE在肾脏大量累积，可通过肾小球系膜细胞上的RAGE介导其功能的改变，引发细胞学效应，诱使许多细胞因子和生长因子的产生和释放，如IL1、IGF1、TNFα、TGFβ、PDGF等，从而加速免疫反应，造成组织损伤。刘辽等[7]研究发现,TNFα、IFNγ刺激可使HaCaT细胞RANTES的mRNA表达与分泌量显著增加。体外试验研究表明，AGE结合RAGE后导致氧化应激，并激活转录因子NFκB [8]，而RANTES的表达受到转录因子NFκB的调控[9];NFκB的激活还可以使RAGE表达上调，进一步促进AGEs与RAGE的结合[10]，而NFκB启动包括促进损伤反应基因在内的相关因子的表达，诱导IL1，TNFα、β表达增多。AngⅡ也可促进肾小球内皮细胞RANTES的表达，这一作用可以被AngⅡ受体拮抗剂所抑制[11]。因此，理论上AGEBSA对HRMC RANTES的诱导作用存在两条通路：(1) AGEBSA直接刺激RANTES的产生;(2) AGEBSA通过NFκB对下游分子的调控或其他细胞因子TNFα、IL1β、TGFβ等间接增加RANTES的表达。本实验结果显示，RANTES 的表达随AGEBSA浓度升高而增加，未出现饱和现象，这说明AGEBSA可能不仅仅是通过受体方式作用于HRMC，也有可能是本实验所设浓度组未达到使其饱和的程度。AGEBSA干预HRMC 6 h 后RANTES mRNA表达就已增加，且直至48 h仍维持在较高水平，从另一个角度证明，RANTES的表达不仅仅是TNFα、IL1β、NFκB、TGFβ等细胞因子的作用结果，因此，我们推测以上两种通路可能同时存在，并可能具有协同作用。其所涉及的具体细胞内信号转导过程尚需进一步研究。

　　综上所述，AGEsBSA能以浓度和时间依赖方式增加HRMC对RANTES的表达，这为糖尿病肾病的研究和防治提供了新的思路。抑制RANTES的表达可能是除抑制AGEs的产生和增加AGEs的清除以外的阻止DN发生发展的有效靶点。

　　【参考文献】

　　[1]Wolf G.New insights into the pathophysiology of diabetic nephropathy：from haemodynamics to molecular pathology[J].Eur J Clin Invest，2004，34(12)：785796.

　　[2]Zilin S，Naifeng L，Bicheng L，et al.The determination of AGEpeptides by flow injection assay，a practical marker of diabetic nephropathy [J].Clin Chim Acta，2001,313(12)：6975.

　　[3]顾晓,赵鸿,杨进,等.趋化因子RANTES对人外周血单个核细胞的免疫活化作用[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(40):79597962.

　　[4]Vielhauer V，Berning E，Eis V，et al.CCR1 blockade reduces interstitial inflammation and fibrosis in mice with glomerulosclerosis and nephrotic syndrome[J].Kidney Int,2004,66(6):22642278.

　　[5]Joo K W，Hwang Y H，Kim J H，et al.MCP1 and RANTES polymorphisms in Korean diabetic endstage renal disease[J].J Korean Med Sci,2007，22(4):611615.

　　[6]李世云，孙子林，刘乃丰，等.AGEBSA对人肾系膜细胞分泌RANTES的影响初探 [J].东南大学学报:医学版,2003，22(6):363365.

　　[7]刘辽,郝杰,杨云霞.黄酮类化合物柚皮苷抑制HaCaT细胞RANTES产生的研究[J].四川生理科学杂志,2008,30(1)810.

　　[8]Singh R，Barden A，Mori T，et al.Advanced glycation endproducts:：a review[J].Diabetologia,2001,44(2):129146.

　　[9]Zoja C，Donadelli R，Colleoni S，et al.Protein overload stimulates RANTES production by proximal tubular cells depending on NFκB activation[J].Kidney Int,1998，53(6):16081615.

　　[10]Morigi M，Angioletti S，Imberti B，et al.Leukocyteendothelial interaction is augmented by high glucose concentrations and hyperglycemia in a NFκBdependent fashionst[J].J Clin Invest,1998,101(9)：19051915.

　　[11]Wolf G，Ziyadeh F N.The role of angiotensin Ⅱ in diabetic nephropathy：emphasis on nonhemodynamic mechanisms [J].Am J Kidney Dis，1997,29(1):153163.