糖尿病患者多药耐药基因mdr1的表达

　　作者：黄治存　　作者单位：733000甘肃武威市中医医院检验科

　　【摘要】目的：体外观察糖尿病患者肝细胞诱导发生胰岛素抵抗(IR)中多药耐药基因mdr1的表达。方法：采用高浓度胰岛素诱发肝源性细胞HepG2建立IR细胞模型(HepG2 IR细胞)，GOD-POD微量化法测定葡萄糖消耗量，RT-PCR检测胰HepG2 IR细胞mdr1基因和胰岛素受体(InsR)mRNA的表达，流式细胞术(FCM)检测P-糖蛋白(P-gp)和InsR蛋白水平。结果：胰岛素诱发HepG2发生IR后，HepG2 IR细胞葡萄糖消耗量降低约10%～45%，InsR基因mRNA表达显著下调、受体表达量降低50.2%～82.9%。胰岛素诱导HepG2细胞产生抗性的过程中，耐药基因mdr1基因表达同步显著增强，mRNA转录增高0.7～2.1倍，P-gp表达阳性细胞增加0.6～1.7倍、表达强度增高。结论：胰岛素诱发的肝脏胰岛素抵抗细胞mdr1基因和P-gp的表达显著增强，提示耐药基因可能与胰岛素抵抗相关联。

　　【关键词】 胰岛素抵抗 HepG2细胞 多药耐药基因1(mdr1)

　　胰岛素抵抗(IR)是机体整体、器官、组织或细胞对胰岛素的敏感性和反应性降低，糖代谢紊乱的慢性病理过程，与2型糖尿病、高血压、脂代谢紊乱、冠心病、动脉粥样硬化等疾病以及肿瘤的发生和发展密切相关。胰岛素信号转导障碍是IR形成的主要机制。有关ABC转运蛋白，特别是P-gp与IR及胰岛素信号转导调控的关系研究尚未见报道。我们假设ABC转运蛋白特别是P-gp在葡萄糖代谢和胰岛素抵抗中具有关键性作用，为证实此假设，笔者采用高浓度胰岛素诱发肝源性HepG2细胞建立胰岛素抵抗细胞模型，观察肝细胞发生胰岛素抵抗过程中mdr1基因和P-gp的表达变化，探讨肝细胞IR与多药耐药基因mdr1表达的关系。

　　资料与方法

　　材料：胰岛素、琼脂糖、溴化丙啶(EB)、二乙基焦炭酸(DEPC)、无酚红和低糖DMEM培养基购自Sigma公司。靶细胞和细胞培养：HepG2细胞由兰州大学医学实验中心保存。HepG2细胞用含10%灭小牛血清的DMEM培养液，37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养。用0.25%胰蛋白酶消化传代，取对数生长期的细胞用于实验。

　　方法：HepG2细胞胰岛素抵抗模型的建立：HepG2细胞接种于含10%小牛血清的DMEM培养基中，待细胞完全贴壁后，用无血清培基洗涤后，更换无血清的DMEM培养液同步化12小时，分别加入1×10-7mol/L、5×10-7mol/L、1×10-6mol/L、5×10-6mol/L和1×10-5mol/L胰岛素，置于37℃、5%CO2培养箱中孵育24小时、36小时、48小时和60小时，弃培养上清液，0.01mol/L PBS洗涤，pH 6.0的DMEM培养液37℃孵育20分钟;0.01mol/L PBS洗涤，用无血清和酚红的DMEM孵育24小时后取上清液，GOD-POD微量化法[1]测定上清液中葡萄糖含量，计算各浓度组细胞的葡萄糖消耗量。通过优化胰岛素的浓度和作用时间建立高浓度胰岛素诱发的HepG2细胞胰岛素抵抗模型用于后续实验。细胞InsR和mdr1基因mRNA表达检测：Trizol试剂提取细胞总RNA，以β-actin为内参照，AMV两步法RT-PCR检测mdrl和InsR的mRNA表达。P-gp表达水平的测定：收集1×10-6mol/L、5×10-6mol/L胰岛素作用36小时和48小时HepG2细胞，PBS洗涤，加入抗P-gp抗体MRK16，室温下孵育15分钟，PBS洗涤，加入RPE标记的羊抗鼠IgG2a单抗，室温下避光孵育15分钟，流式细胞仪(FCM)检测细胞P-gp蛋白表达阳性率和平均荧光强度(MFI)[2]。

　　InsR表达水平的测定：收集胰岛素诱导的HepG2细胞，PBS洗涤。加入抗InsR单抗，室温孵育30分钟，PBS洗涤，加入FITC标记的羊抗鼠IgG抗体，室温下避光孵育15分钟，PBS洗涤，FCM检测InsR的表达阳性率和MFI[3]。

　　结 果

　　胰岛素诱导的HepG2胰岛素抵抗细胞模型：1×10-7mol/L～1×10-5mol/L胰岛素诱导不同时段，HepG2细胞对葡萄糖的消耗量显著降低(P<0.05～0.01)，且随胰岛素浓度增加和时间延长消耗量逐渐减少。36小时和48小时时细胞生长状态良好，且对葡萄糖的摄取量减少趋势稳定。1×10-6mol/L和5×10-6mol/L胰岛素诱导36小时和48小时，HepG2细胞的葡萄糖消耗量分别降低11.96%、13.55%、20.52%和25.99%。诱导60小时，HepG2细胞的葡萄糖消耗量进一步降低，最高可达44.86%，但对照细胞也降低，且细胞生长状态明显不佳，死亡细胞显著增多。因此，高浓度胰岛素诱导36～48小时可建立稳定的胰岛素抵抗细胞模型(HepG2 IR细胞)。

　　HepG2 IR细胞InsR mRNA表达降低，InsR数量减少：HepG2细胞InsR 基因mRNA呈高表达。1×10-6mol/L和5×10-6mol/L胰岛素分别诱导36小时和48小时，InsR mRNA表达显著降低，分别下降38.36%、49.71%、16.67%和28.33%，48小时时略有回升。1×10-6mol/L和5×10-6mol/L胰岛素诱导36和48小时后，InsR蛋白表达量(平均荧光强度，MFI)显著降低，36小时由对照的20.4分别降至9.57和3.66;48小时时由对照的22.7分别降至11.3和3.89，降低50.2%～82.9%。

　　HepG2 IR细胞mdrl基因表达增高：HepG2细胞mdrl基因呈低水平表达。1×10-6mol/L和5×10-6mol/L胰岛素诱导36及48小时发生IR后，HepG2 IR细胞mdrl mRNA表达显著增高，分别增高0.67、1.50、1.00和2.07倍。P-gp的合成也显著增加，阳性细胞分别由15.3%提高到35.3%和37.3%(36小时)、22.5%和43.9%(48小时)，表达强度(MFI)也相应增高。mdr1/P-gp表达增高与InsR降低及葡萄糖消耗量减低相一致。

　　讨 论

　　药物耐受(抵抗)现象是临床疾病治疗的棘手问题，特别是感染性疾病的抗生素耐药现象和肿瘤治疗中的抗癌药物耐受现象严重制约着临床相关疾病的治疗效果。鉴于ABC转运蛋白特别是P-gp与药物敏感性的密切关系，IR发生和胰岛素信号传导的特点，以及P-gp在正常机体组织中的分布特点和在药物的吸收、分布、代谢、清除、敏感性和耐受性等方面的关键作用，其是否与IR的发生发展有关，是否参与IR的调控等，目前尚未见报道。

　　本研究中，我们以高浓度胰岛素诱导HepG2细胞建立了IR细胞模型，发现IR细胞葡萄糖的摄取量明显降低，同时，胰岛素受体基因mRNA表达明显下降，胰岛素受体数量显著减少，符合IR的特点。首次发现在胰岛素诱导HepG2细胞产生抗性的过程中，耐药基因mdr1 mRNA显著增高，药物转运蛋白P-gp的合成也明显增加，与IR细胞葡萄糖消耗量及InsR表达量呈负性相关。提示mdr1/P-gp的表达可能与细胞葡萄糖的代谢和IR形成相关。

　　研究发现，胰岛素可刺激肿瘤细胞mdr1的表达[4]，若细胞培养中如果祛除葡萄糖(葡萄糖剥夺)也可促进细胞P-gp的表达[5];Morand观察了果糖诱导的仓鼠IR模型肝脏蛋白表达谱，发现包括P-gp在内的多种内质网相关蛋白增高[6]。这些研究资料也提示P-gp可能参与IR或细胞葡萄糖代谢，但P-gp与IR的确切关系如何，P-gp是否与InsR、GLUTs等胰岛素信号相关膜蛋白相互作用(cross-talk)，调控胰岛素信号传导而参与IR过程，或IR发生发展过程中P-gp的作用等尚需做大量的深入研究工作。

　　【参考文献】

　　1 杨桂枝,高小平,晏菊芳,等.GOD-POD法微量化测定方法的建立及其在3T32L1脂肪细胞和Hep G2细胞糖摄取中的应用.四川解剖学杂志,2003,11(1):13-15.

　　2 Wang DH,Wei HL,Zhao HS,et al.Arsenic trioxide overcomes apoptosis inhibition in K562/ADM cells by regulating vital components in apoptotic pathway.Pharmacol Res,2005,52(5):376-378.

　　3 Macaulay SL,Polites M,Frenkel MJ,et al.Mutagenic structure/function analysis of the cytoplasmic cysteines of the insulin receptor.Biochem J,1995,306(3):811-820.

　　4 Zhou G,Kuo MT.NF-KB-mediated induction of mdr1b expression by insulin in rat hepatoma cells.J Biol Chem,1997,272(24):15174-15183.

　　5 Ledoux S,Yang R,Friedlander G,et al.Glucose depletion enhances P-glycoprotein expression in hepatoma cells:Role of endoplasmic reticulum stress response.Cancer Res,2003,63(21):7284-7290.

　　6 Morand JPF,Macri J,Adeli K.Proteomic profiling of hepatic endoplasmic reticulum-associated Proteins in an animal model of insulin resistance and metabolic dyslipidemia.J Biol Chem,2005,280(18):17626-17633