甘油三酯肾毒性及其加重大鼠阿霉素肾病的初步研究

　　作者：傅鹏　袁伟杰　俞国庆　于光　许静　崔若兰

　　作者单位： 200433 上海 第二军医大学附属长海医院肾内科

　　【摘要】目的探讨甘油三酯(TG)是否具有肾毒性以及外源性TG对阿霉素肾病大鼠的影响。方法雄性SD大鼠40只，分为5组，即C组：正常对照组，F组：果糖饲喂组，A组：ADR肾病组，FA组：ADR肾病+果糖饲喂组，FAB组：ADR肾病 + 果糖饲喂组 + 非诺贝特治疗组(n=10)。实验周期为16周。在实验前、实验后第2、8和16周分别抽空腹血查肾功能、白蛋白、血脂。抽血次日留24h尿测尿蛋白定量。实验结束时采血留尿后宰杀动物，留取肾组织行光镜下观察HE、油红O染色病理学改变，测定肾脏内纤维连接蛋白(FN)和转化生长因子β(TGF-β)的含量。结果饲喂果糖可造成大鼠食饵性高TG血症，但肾脏基本无病变，肾脏内少见脂质沉积;而饲喂果糖可显著升高阿霉素肾病大鼠的血TG水平，尿蛋白排泄量显著增多，肾脏病理改变加重，肾小球和肾小管内脂质沉积增加，肾皮质FN和TGF-β的含量均较食饵性高甘油三酯血症大鼠显著增加或增强;而以吉非罗齐降低大鼠血浆甘油三酯水平后大鼠尿蛋白排泄量减少以及肾脏病理减轻，肾脏内脂质沉积明显减少，肾皮质内FN和TGF-β的含量下降。结论高TG血症对SD大鼠肾脏具毒性作用，并可加重阿霉素肾病大鼠病情和肾脏病理，提示临床重视和治疗高TG血症的必要性和紧迫性。

　　关键词:甘油三酯阿霉素;肾病;肾脏病理转化生长因子;β纤维连接蛋白

　　Initial study on triglyceride-nephrotoxicity and exacerbation of adriamycin-induced nephropathy by hypertriglyceridemia in rats

　　Fu Peng,Yuan Weijie,Yu Guoqing,et al.

　　Department of Nephrology,Changhai Hospital Affiliated to Second Military Medical University,Shanghai 200433.

　　【Abstract】ObjectiveTo evaluate the possibility of triglyceride nephrotoxicity in rats and the role of exogenous triglyceride on adriamycin-induced nephropathy.Methods40 male SD rats were divided into 5 groups,that was normal controls(Group C,n=6),fructose fed group(Group F,n=8),adriamycin-induced nephropathy group(Group A,n=8),fructose fed nephropathy group (Group FA,n=10),fructose fed nephropathy rats treated with drugs (Group FAB).Group F rats drunk tap water containing fructose of 10 percent.Group A rats were injected with 6 mg/kg of adriamycin solution once.Group FA rats drunk water containing fructose of 10 percent.Group FAB rats were treated with 3 microgram fenofibrate per day.The experiment lasted for 16 weeks.The measurement of serum triglyceride and cholesterol and assessment of renal function and serum albumin and urine protein excretion amount were done during fixed intervals.The histological changes in renal tissues of rats were observed under microscope.The contents of fibronectin(FN)and transforming growth factor-β(TGF-β)in renal cortexes of rats were measured.ResultsThe animal study showed that the amount of urinary albumin excretion(UAE)in fructose-induced hypertriglyceridemia rats(Group F)was very small.The renal histological changes were mild with less lipid deposit within glomeruli or tubulo-interstitium.The adriamycin-induced nephrotic rats with endogenous hypertriglyceridemia were fed with food containing 10% fructose(Group FA).The serum triglyceride level and amount of UAE in group FA rats were higher than those in group F,and the renal histological changes were exacerbated，lipid deposit could be seen in glomeruli and interstitium.The amount of fibronectin and transforming growth factor β(TGF-β)in renal cortex both increased.After serum triglyceride were decreased by fenofibrate,there were less lipid deposition in kidneys of rats(Group FAB),the UAE decreased and renal histological changes improved.The amount of FN and TGF-β in renal cortexes were down-regulated.ConclusionThese results indicated that hypertriglyceridemia expresses nephrotoxicity to rats and may exacerbate adriamycin-induced nephropathy.Triglyceride may do more harm to kidneys of animals and human than we had understood.

　　Key wordstriglycerideadriamycin-induced nephropathyrenal histological changetransforming growth factor-βfibronectin

　　人们对肾脏病与高胆固醇血症的关系目前已有较深程度的认识，已明确高胆固醇血症可通过脂质在肾小球内的沉积，启动对肾脏的损害，表现出“肾毒性”[1]，而对高甘油三酯(TG)血症与肾脏病关系如何所知甚少。晚近研究结果表明，TG可能与胆固醇一样，作为一个独立的危险因素，在肾脏病的发生、发展以及预后中起着重要的作用。为证明此点，笔者以临床和肾脏病理改变酷似人类局灶节段性肾小球硬化的阿霉素(ADR)肾病[2]作为实验动物进行了长达16周的实验观察，以明确外源性高TG血症是否造成肾脏损害以及其能否加重原有的肾小球病变，从而初步了解TG有无肾毒性。

　　1资料与方法

　　1.1动物和试剂雄性SD大鼠40只，体重160～200g，上海第二军医大学实验动物中心提供。果糖由上海增健试剂公司进口分装，非诺贝特(商品名利必非)由上海爱克发制药有限公司惠赠，血脂检测试剂盒为上海长征制剂公司产品，尿纤维连接蛋白(FN)检测试剂盒为上海太阳生物技术公司产品，RT-PCR检测试剂盒为Promega公司产品。

　　1.2动物分组大鼠在适应性喂养2周后，按照完全随机设计原则分为5组：(1)正常对照组(C组，n=6)：大鼠接受单次尾静脉注射6ml/kg体重的生理盐水，饮自来水;(2)果糖饲喂组(F组，n=6)：大鼠接受单次尾静脉注射6ml/kg体重的生理盐水，饮含10%果糖的自来水;(3) ADR肾病组(A组，n=8)：大鼠接受单次尾静脉注射6mg/kg的阿霉素溶液，饮自来水;(4)ADR肾病+果糖饲喂组(FA组，n=10)：大鼠接受单次尾静脉注射6mg/kg的阿霉素溶液，饮含10%果糖的自来水;(5)ADR肾病 + 果糖饲喂组 + 非诺贝特治疗组FAB组，n=10)：大鼠接受单次尾静脉注射6mg/kg的阿霉素溶液，饮含10%果糖的自来水，并于2周后每日给予3mg非诺贝特(商品名利必非)灌胃。

　　1.3实验周期和方法实验周期为16周。在实验前、实验后第2、8和16周末称量体重，并分别抽空腹血查肾功能、肝功能、血总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)。抽血次日留24h尿测尿蛋白定量。实验结束时采血留尿后宰杀动物，留肾组织分别行光镜HE、油红O(ORO)染色病理学观察。并测定肾组织中FN的分布以及转化生长因子β(TGF-β)的蛋白和基因表达。采用磺基水杨酸法测定尿蛋白定量，采用酶法测定血TC、TG，以常规生化分析仪测定肾功能、血白蛋白和球蛋白。以免疫组化法观察肾脏内FN的分布，以ELISA法测定肾组织中TGF-β的表达。

　　1.4统计学处理所有指标均以均数±标准差(±s)表示，采用配对资料t检验进行统计学分析，以P<0.05表示为统计学差异有显著性。

　　2结果

　　2.1肝、肾功能变化实验周期内，各组大鼠肝功能和肾功能均无明显的变化。

　　2.2血脂变化实验进行到2周时，F组和A组大鼠血清TG、VLDL水平升高，FA组大鼠血清TG、VLDL水平进一步升高，均显著高于C组(P<0.01);而胆固醇、LDL、HDL和LP(a)水平与C组相比差异无显著性;FAB组大鼠2周时各项血脂指标与除C组以外的各组差异无显著性，显著高于C组(P<0.01)，但8周时血清TG、VLDL水平较FA组明显下降(P<0.01)，而较F组和A组大鼠血清TG、VLDL水平差异无显著性，见表1。

　　2.3各组大鼠尿蛋白排泄量的测定C组和F组大鼠实验周期中尿蛋白排泄量无明显变化，A组大鼠自实验第2周起尿蛋白排泄量明显增加，至实验结束时排泄量最多;FA组大鼠在第2周起的各个时间段尿蛋白排泄量均显著高于A组，而FAB组大鼠在第2周起的各个时间段尿蛋白排泄量均显著低于FA组，其中实验结束时的尿蛋白量较FA组减少差异有显著性(P<0.05)，见表2。

　　表1实验过程中各组大鼠血脂水平(略)

　　注：与C组比较P<0.05 ，**P<0.01;与FA组比较△P<0.05

　　表2实验过程中各组大鼠尿蛋白排泄量的变化(略)

　　注：与C组比较**P<0.01;与FA组比较△P<0.05

　　2.4肝、肾病理改变

　　2.4.1常规HE染色实验结束时C组大鼠肾组织内未见肾小球细胞及系膜基质的增加，肾小管和间质、肾血管均未见病变。F组大鼠肾组织肾小球内细胞轻度增生，系膜基质增加，肾小管和间质未见明显病变，部分肾血管壁增厚，内弹力层增生。而A组大鼠肾小球显著增大，与肾小球囊粘连，球内细胞明显增多，细胞外基质增多，球内部分区域玻璃样变和纤维化;多数肾小管管腔扩张，部分肾小管管腔极度扩张，腔内充填蛋白管型，小部分小管萎缩，间质少量炎细胞浸润(见图1);FA组肾小球和肾小管病变均较A组加重，表现为肾小球内节段性硬化灶增多，百分率增加，大量肾小管腔内充满蛋白管型，间质炎细胞浸润增多，并伴间质纤维化，部分肾小血管管壁增厚，管腔狭窄，腔内可见粥样硬化斑块(见图2);而FAB组大鼠肾小球、肾小管病变均较FA组有不同程度的减轻，肾小球局灶性硬化百分率下降，间质炎细胞浸润和纤维化减轻，肾小血管病变改善。以上结果提示降甘油三酯治疗对阿霉素肾病病程和病理的改善作用。

　　2.4.2ORO染色实验结束时，C组大鼠肝和肾组织切片上没有发现脂质的沉积， F组大鼠肾组织中未见脂质沉积，而肝组织中见较多沿汇管区呈放射状大小不等的红色的阳性脂质沉积。A组大鼠肾组织切片上见肾小球内较少的脂质沉积，沉积部位主要在肾小球内(见图3)，肾小管相对较少，肾血管壁内未见脂质沉积;FA组大鼠肾组织内则见多数肾小球内大块状脂质沉积(见图4)，部分肾小管壁上也见脂质沉积，呈灶性分布，肾血管壁内也未见脂质沉积;FAB组大鼠肾小球和小管内脂质沉积均较FA组减少，程度减轻，脂质沉积同样未累及肾血管。

　　2.4.3免疫组化观察肾组织切片行纤连蛋白(FN)和免疫组化，结果示：C组和F组大鼠肾组织内两种蛋白的表达很少，而A组大鼠肾组织内FN和TGF-β1表达明显增强，主要表达部位在肾小球和肾血管，肾小管间质几乎无表达。FA组大鼠肾组织两种蛋白的表达更强，而以降脂药物吉非罗齐降低血中甘油三酯水平，则使两种蛋白表达受到抑制，见表3。

　　表3各组大鼠肾组织FN和TGF-β1的表达(略)

　　2.5肾组织纤连蛋白(FN)和转化生长因子β(TGF-β)的蛋白表达对肾组织匀浆上清液进行FN蛋白含量测定的结果表明，试验结束时肾组织FN含量F组大鼠较C组无明显变化，而A组大鼠显著升高，FA组升高更明显，予降脂药物后FAB组则有所下降，差异有显著性(P<0.05)。肾组织含量变化趋势与FN一致，见表4。

　　表4各组大鼠肾组织中FN和TGF-β1的蛋白含量(略)

　　注：与C组比较P<0.05 ，**P<0.01;与FA组比较△P<0.05

　　3讨论

　　肾脏病进展过程中受到多种因素的影响，其中高脂血症是加速肾脏病进展的重要因素之一。但既往的研究多侧重于高胆固醇血症对肾脏的致病作用及其机制的探讨，而对高TG血症与肾脏病的关系研究较少。

　　高TG血症广泛存在于多种肾脏疾病如肾病综合征[3]、糖尿病肾病、慢性肾功能衰竭非透析和透析患者中[4]。鉴于高胆固醇血症对肾脏的肾毒性已经基本明确，人们很自然地推测高TG血症是否具有肾毒性。有临床研究结果表明，肾脏病患者血清TG水平与尿蛋白排泄量呈正相关[5];而且原发性肾脏疾病患者血清TG及apoE水平与肾小球滤过率(GFR)的下降具有显著的相关性，而且富含TG的apoB比富含胆固醇的apoB肾功能的下降相关性更强，TG水平高者，肾功能下降更快[6]。

　　本研究以SD大鼠为研究对象，试图明确外源性高TG血症是否具有肾毒性，对原有肾脏病的大鼠肾脏损害有无加重作用，以及采用药物降低血TG水平对肾脏有无保护作用。

　　本课题的结果表明，果糖诱导的食饵性高TG血症大鼠尿蛋白排泄量较少，肾脏病理改变较轻，肾脏内基本上没有脂质沉积;伴有内源性高TG血症的阿霉素肾病大鼠喂食果糖加重高TG血症的同时，大鼠尿蛋白排泄量显著增多，肾脏病理改变加重，肾小球和肾小管内均见脂质沉积;而以吉非罗齐降低大鼠血浆TG水平后大鼠尿蛋白排泄量减少以及肾脏病理减轻，肾脏内脂质沉积明显减少。这些结果初步从症状和形态学方面证明，高TG血症的确具有肾毒性，且可加重阿霉素肾病的进展和恶化。

　　对肾脏内反映细胞外基质增生的肾皮质FN[7]和TGF-β[8]的研究表明，二者含量以及后者的mRNA表达在伴有内源性高TG血症的阿霉素肾病大鼠均较单纯食饵性高TG血症的健康大鼠显著增加或增强;而以吉非罗齐治疗后，随着血TG水平的下降以及大鼠尿蛋白排泄量和肾脏病理改变的减轻，肾皮质内FN和TGF-β的含量也下降，TGF-β mRNA表达相应减弱。

　　TG肾毒性的发生机制目前尚不清楚。目前研究认为，高TG血症对肾脏的损害与脂质在肾小球内的沉积、TG对系膜细胞的影响以及肾小球内单核-巨噬细胞的聚集并活化有关。脂质在肾小球内的沉积从机制上可分为受体介导性和非受体介导性。TG对系膜细胞的作用表现在细胞膜上TG受体与血液循环中的TG结合并将其摄入细胞内、系膜细胞的增殖、产生活性氧分子以及细胞外基质如FN的增生分泌过多。肾小球内皮细胞的损伤，导致肾小球内单核-巨噬细胞的聚集并激活，进而释放出细胞因子如TGF-β等、蛋白酶以及活性氧分子等，并使内皮细胞促凝活性增强，血管舒缩物质活性改变，肾小球内纤维素沉积，FN等细胞外基质增多。最终肾小球逐渐趋于硬化。晚近研究表明，高TG血症和高胆固醇血症均可能在早期首先造成肾小球脏层上皮细胞(足细胞)变性以及小管间质细胞激活损伤，后期才引起系膜细胞增殖，系膜外基质分泌过多[9]。

　　综上所述，本课题研究结果表明，TG确具有肾毒性，大鼠原有阿霉素肾病可因血浆TG水平升高而加重;而有效地降低血浆TG浓度可延缓肾脏病的进展和恶化。提示临床上重视和治疗肾脏病高TG血症的重要性。而“TG肾毒性”确切的发病机制有待进一步深入研究。

　　(本文图片见封三)(略)

　　参考文献

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　　2Okuda S,Oh Y,Tsuruda H,et al.Adriamycin-induced nephropathy as a progressive glomerular disease.Kidney Int，1986，29(2):502-510.

　　3Wheeler DC.Lipid abnormalities in the nephritic syndrome:the therapeutic role of statins.J Nephrol，2001，14(Suppl 4):S70-S75.

　　4Ikejiri A,Hirano T,Murayama S,et al.Effects of atorvastatin on triglyceride-rich lipoproteins,low-density lipoproteinsubclass,and C-reactive protein in hemodialysis.Metabolism，2004，53(9)：1113-1117.

　　5Nosadini R,Clipollina MR,Solini A,et al.Close relationship between microalbuminuria and insulin resistance in essential hypertension and non-insulin dependent diabetes mellitus.J Am Soc Nephrol，1992，(Suppl 3):S56-S63.

　　6Samuelsson O,Mulec H,Knight-Gibson C,et al.Lipoprotein abnormalities are associated with increased rate of progression of human chronic renal insufficiency.Nephrol Dial Transplant，1997，12(9):1908-1915.

　　7Tang WW,Feng L,Loskutoff DF,et al.Glomerular extracellular matrix accumulation in experimental anti-GBM Ab glomerulonephritis.Nephron，2000，84(1):40-48.

　　8Kim TS,Kim JY,Hong HK,et al.mRNA expression of glomerular basement membrane proteins and TGF-beta1 in human membranuous nephropathy.J Pathol，1999，189(3):425-430.

　　9Joles JA,Kunter UTA,Janssen ULF,et al.Early mechanisms of renal injury in hypercholesterolemic or hypertriglyceridemic rats.J Am Soc Nephrol，2000，11(4):669-683.