PDX1与糖尿病

　　作者：姜铧,张洹,李东升　　作者单位：1暨南大学医学院血液病研究所;2郧阳医学院附属太和医院湖北省胚胎干细胞重点实验室，湖北 十堰 442000

　　【关键词】 PDXI,糖尿病,胰岛素

　　随着人们生活水平的提高，糖尿病的发病率越来越高。传统的治疗措施存在不足，新的治疗方法越来越受到人们的关注。PDX1作为对胰腺发育、胰岛细胞分化和胰岛素合成具有重要作用的转录因子，在糖尿病新的治疗方法中引起广泛的关注，并有可能成为糖尿病治疗的一个新的靶标。现将近年来有关PDX1作用机制及其与糖尿病治疗的相关研究进展综述如下。

　　1 PDX1及PDX1蛋白

　　PDX1即胰岛十二指肠同源盒-1(PDX1)，又称为胰岛素启动因子(IPF-1)、生长抑素活化因子( STF-1)、葡萄糖反应性特异转录因子(GSF)等。人类PDX1基因全长约6 kb，包含2个外显子，其编码区由283个氨基酸组成，相对分子量31 kD。PDX1基因分别定位于人类、小鼠和大鼠的13、5和12号染色体上[1]。PDX1基因的编码区包括两个外显子,一个编码氨基端区域，一个编码同源结构域和羧基端区域。PDX1基因的两个活化区域分别位于氨基端区域内和DNA结合区内。

　　PDX1蛋白结构由多个功能区构成。其中转录活化区存在于氨基末端，包括1~77个氨基酸，由三个高度保守的亚区组成。点突变分析证明转录活化区为激活胰岛素基因转录所必需[2]。而同源结合域区(HD)含有一个由7个氨基酸组成的核定位信号，可能与葡萄糖或胰岛素诱导的PDX1蛋白磷酸化在细胞核和细胞浆之间穿梭有关，是PDX1发挥转录因子作用的区域。PDX1通过HD区与其调控的基因启动子DNA结合，而激活其转录。HD区还可以与其他转录因子通过蛋白-蛋白相互作用发挥协同转录激活作用。

　　2 PDX1的作用机制

　　2.1 PDX1促进胰腺发育和胰岛细胞分化

　　PDX1在胰腺发育中有很重要的作用，是胰腺发育的重要转录因子之一。胰腺发生于原始消化管十二指肠前端,在胚胎发育的第13~14天背侧胰芽和腹侧胰芽融合形成胰腺,同时胰腺原始未分化导管上皮细胞在第9.5~15天分化形成胰岛内分泌和外分泌细胞。这个过程依赖于多种转录因子和信号转导分子之间在时间和分布上的精确调控，其中PDX1是胰腺定向发育成熟过程中已知的第一个也是最重要的转录因子。小鼠PDX1基因最早在胚胎发育第8.5天的内脏内胚层中表达，随后出现于第9.5天的α细胞，第10.5天的β细胞，第15.5天的δ细胞和出生后的PP细胞。小鼠PDX1的表达在第10.5天达到最高水平，随后逐渐下降，在出生及成年后, PDX1仅特异性表达于90%的β细胞和少量的(10% )δ细胞[3]。

　　研究发现[1,4]，PDX1纯合缺失小鼠可以出现早期胰芽发育受阻，导致胰腺发育不全，找不到成熟的胰腺组织，还可以出现十二指肠区域异常，出生后不久即死于高血糖症。PDX1 杂合缺失小鼠尽管胰腺的发育正常，但成年后可以出现糖耐量异常及糖尿病。同样，人类的PDX1基因移码突变也可导致胰腺的发育不全，而杂合子的PDX1点突变与家族性MODY2 (maturity onset diabetes of the young)糖尿病有关。

　　2.2 PDX1调控胰岛β细胞的增生和凋亡

　　细胞的增生与凋亡对于维持细胞的数目稳定和功能非常重要。在正常成年个体，β细胞的生存期为60 d左右，β细胞的凋亡率维持在0.5%以下。在整个成年过程中，β细胞量保持相对稳定,维持在最佳水平。在老年期，胰岛细胞的凋亡超过了增生,β细胞数量减小,这在一定程度上解释了随年龄增长糖尿病易患性增加的原因。在胚胎发育时期,PDX1和PBX基因共同作用，促进胰腺导管细胞转变为胰岛β细胞。在胰腺大部切除后，PDX1表现出明显的促增生作用，这个过程类似于胚胎发育时期胰腺的形成[5]。另一方面，PDX1可以抑制胰岛细胞的凋亡。PDX1+/-胰岛细胞对凋亡因子的敏感性增强，细胞中抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl -XL减少，而凋亡相关蛋白Caspase3活性增强，胰岛的凋亡数增多，胰岛数目减少，胰岛体积缩小， 胰岛素的分泌减少[6]。

　　此外，PDX1还可以实现胰高血糖素样肽(GLP-1)的促胰岛细胞增生作用。GLP-1是肠道细胞分泌的一种肽类激素,它可以促进胰岛素的分泌，并且在胰岛细胞增生中也起重要作用,但其功能的发挥，需要依赖于PDX1基因的正常表达。Li等[7]研究发现， GLP-1受体激活剂E4可以刺激PDX1+/+小鼠β细胞增殖明显增强，细胞中标记新生细胞的BrdU阳性细胞数明显增多，β细胞凋亡数无明显变化。而在PDX1-/-小鼠中β细胞增殖无明显变化，但β细胞凋亡数明显增加，进一步证实了PDX1基因在胰岛细胞的增生和凋亡中的作用。

　　2.3 PDX1调控胰岛素基因和胰岛素分泌相关基因的表达

　　PDX1在转录水平通过与胰岛素基因启动子和增强子区域的转录因子结合位点结合，从而对胰岛素基因表达及胰腺的发育发挥重要作用。无论正常状态或者糖尿病情况下，PDX1 均介导葡萄糖刺激下的胰岛素基因的转录。在成体胰岛β细胞，短期高血糖环境可促进PDX1与胰岛素基因的结合，提高胰岛素mRNA 的水平;但在长期高血糖对β细胞毒性作用下，PDX1和胰岛素水平均下降。胰岛素基因表达的缺陷主要是由于长期高糖产生氧化应激激活了JNK途径，直接抑制了胰岛素基因的表达，并抑制了两种主要转录因子PDX1和MafA的活性[8-10]，后两者是胰岛素启动子活化的主要参与者。而大鼠胰岛素启动子或人类相应位点发生点突变可导致启动子活性明显下降[11]，进而影响到胰岛素基因的表达。

　　同时，PDX1对胰岛素分泌相关基因亦有调控作用。葡萄糖激酶(glucokinase, GK)和葡萄糖转运体(GLUT2)在葡萄糖刺激的胰岛素分泌过程中具有重要的作用。PDX1对GK和GLUT2具有调控作用，PDX1可以与GK基因的顺式作用元件结合，启动GK基因的转录。PDX1还可以与GLUT2的TATA盒结合,启动其转录。PDX1 基因缺失可以使GK和GLUT2基因表达下降，进而使β细胞内的GK和GLUT2 mRNA水平下降，GK和GLUT2合成减少，导致葡萄糖诱导的胰岛素分泌减少。此外，PDX1还可以调控其他与胰岛素分泌相关基因如胰淀素( amylin)，Synap tophysin等的表达，从而影响β细胞刺激胰岛素分泌功能及胰岛素分泌时相的改变[12]。

　　3 PDX1与糖尿病治疗

　　由于PDX1在胰腺发育、胰岛β细胞分化以及胰岛素的分泌利用方面发挥重要的作用，因此，以PDX1为靶基因，对非β细胞进行直接或间接修饰，使其具有胰岛素分泌功能，很可能是今后糖尿病基因治疗中极具潜力的一个发展方向。近年来已出现了一些可喜的结果。

　　3.1 体内实验

　　PDX1 基因可以在不同载体的介导下直接导入体内，诱导非β细胞中内源性胰岛素的表达[13-14] 。Ferber等[13]将以腺病毒为载体的PDX1基因注入小鼠尾静脉，发现在肝脏异位表达的PDX1可诱导肝内源性胰岛素基因的表达，且同时诱导激素原转换酶(prohormone convertase)IP3的表达，因而小鼠肝脏可产生具有生物活性的胰岛素，逆转链脲佐菌素(STZ)导致的糖尿病;异位表达的PDX1还可诱导将近1%的肝细胞分化成具有β细胞表型的细胞。进一步研究证实，在体内PDX1有足够的能力诱导肝细胞分化为胰腺内分泌细胞，尤其是在它本身被诱导表达后(内源性PDX1在肝脏开始表达)，糖尿病小鼠可获得持续稳定的正常血糖水平(超过120 d) [15]。日本的两个实验室也遵循同样的思路，分别采用新一代腺病毒(helper-depended AV)为载体来介导PDX在小鼠体内的表达和导入重组腺病毒PDX1 -VP16 进入小鼠体内的方法[16]，再次证实了PDX1可诱导肝细胞转变为胰腺内分泌和外分泌细胞。2004年Koizumi等[17]发现，导入PDX1基因的同时进行肝切除手术的STZ糖尿病小鼠，其肝脏中出现胰岛素分泌细胞的数量相对较多。3个独立的实验室得到了相似的结果，说明在这种体内模型中，PDX1确实能够诱导肝细胞分泌胰岛素。2005年，Zhao等[18]应用人的胰腺非内分泌细胞，在β细胞调节素、尼克酰胺、激活素A及葡萄糖等存在的培养条件下瞬时转染PDX1后进行移植，可逆转STZ诱导糖尿病小鼠的高血糖症状。Chen等[19]应用超声介导微泡破裂技术将PDX1和β细胞调节素基因导入STZ诱导糖尿病大鼠体内，能通过提高胰岛素产量而逆转糖尿病大鼠高血糖水平。

　　3.2 体外实验

　　在体外对某些非β细胞或干细胞进行PDX1基因修饰，使其转化成为胰岛素分泌细胞后，可用于移植治疗糖尿病。2003年，Zalzman等[20]以慢病毒为载体，将PDX1基因导入已经转染端粒酶的人胎肝细胞，获得了可表达胰岛素的永生化细胞系。这些细胞分泌胰岛素的水平受葡萄糖的调节;移植后可以使非肥胖糖尿病(NOD/SCID)小鼠的血糖维持正常达80 d。2004 年，Yang等[21]将PDX1-VP16稳定转染大鼠肝脏细胞系WB21后，诱导出多种胰腺内分泌相关基因的表达，但只有在高糖诱导后(在含21 mmol/L葡萄糖培养基中培养)，或移植入糖尿病小鼠的肾包囊下，才有β细胞特异性基因(包括胰岛素、Pax4、Pax6、Maf和胰岛因子-1基因)的表达。另外，Nakajima-Nagata等[22]发现腺病毒介导的PDX1可以增强成年大鼠肝脏干细胞向胰腺内分泌细胞转化的能力，并促进胰岛素的分泌。2005年Sapir等[23]体外培养成人肝脏和胎肝，并加入了表皮生长因子和尼克酰胺等诱导成分，而后转染以腺病毒为载体的PDX1，在肝细胞中可检测到胰岛素基因的表达，并且是以葡萄糖依赖的方式发挥作用。将这些细胞移植到STZ诱导糖尿病小鼠肾包囊下，可改善高血糖症状。Fodor等[24]用慢病毒载体将PDX1基因导入成年大鼠肝脏细胞内，体外在mRNA水平和蛋白水平均可以检测到胰岛素的表达，移植到体内，能使STZ诱导的SCID糖尿病小鼠血糖明显降低。

　　PDX1也能诱导干细胞分泌胰岛素。Miyazaki 等[25]将PDX1基因定点整合入Tet-off系统的ROSA26位点，转入人胚胎干细胞系，进行可调性的表达,观察到分化的干细胞中胰岛素及其相关基因的表达有明显上调，并可用来移植治疗糖尿病。Kwon等[26]通过跨膜转导技术将TAT-PDX1蛋白直接导入到人胚胎干细胞内，从而诱导人胚胎干细胞分化为胰岛素产生细胞。Tang等[27]以慢病毒为载体，将PDX1-VP16导入肝脏干细胞，可诱导其成为功能性的胰岛素分泌细胞。

　　以上实验说明，PDX1 在诱导非β细胞转化为胰岛素分泌细胞的过程中发挥了重要作用。但是，在某些情况下，单纯PDX1 还不足以使非β细胞发生表型转化而分泌胰岛素，必须有其他因子如VP16、ISL1和BETA2等的协同，或将这种稳定表达的细胞进一步置于各种体外(高糖环境培养、生长因子诱导)或体内(肾包囊腔)环境中继续诱导，才有可能使内源性胰岛素表达。

　　4 展望

　　糖尿病的治疗是一项系统而复杂的工程，传统的治疗可能会延缓疾病的进展，但始终无法治愈，以PDX1为靶标的细胞治疗为我们提供了一个攻克糖尿病的方向。但从已有的实验结果不难看出,并非将PDX1的cDNA或PDX1蛋白导入非β细胞后启动胰岛素基因表达等处理后，这些细胞就一定能分泌胰岛素。说明PDX1虽是关键的，但不是唯一可启动其他细胞向β细胞转化的因子，可能还存在其他重要的辅助因子，如ISL1、BETA2、NeuroD1、PAX4 等，同时还需多种促诱导条件协同作用。而且这些能分泌胰岛素的非β细胞进入体内分泌的胰岛素是否能随血糖水平波动也不得而知。这也从另一个侧面说明了胰岛素基因表达调控的复杂性。但是我们有理由相信，随着对糖尿病基础研究的深入，以及细胞治疗、分子靶向介入等技术的进展，以PDX1为靶标治疗糖尿病必将走向临床，造福广大的糖尿病患者 。

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