重组人载脂蛋白E3在毕赤酵母中的分泌表达及鉴定

　　　作者：苏曼曼,陈 月,王文佳,许天敏,常伟勤,颜炜群,包晓群 作者单位：吉林大学药学院，吉林 长春 130021

　　【摘要】 目的 在毕赤酵母中高效表达重组人载脂蛋白E3(rhApoE3)，制备与天然hApoE3具有相同结构和活性的rhApoE3。方法 用RTPCR法自人肝组织RNA克隆hApoE3的cDNA，构建真核分泌型表达载体pPICZα/hApoE3。经核酸测序确证后，电转化毕赤酵母菌株X33。甲醇诱导后进行SDSPAGE、Western印迹分析，筛选高表达工程菌。结果 经PCR法克隆的hApoE3 DNA序列与GenBank登录的序列一致。SDSPAGE和Western印迹分析均在分子量约34kD出现特异性条带，rhApoE3表达量达150mg/L。结论 在毕赤酵母菌中可经甲醇诱导产生rhApoE3，获得高效表达rhApoE3的毕赤酵母工程菌。

　　【关键词】 重组人载脂蛋白E3;分泌表达;毕赤酵母

　　ApoE3是对动脉粥样硬化最具有保护性的ApoE亚型〔1～6〕。本实验旨在利用毕赤酵母大量制备重组人ApoE3(rhApoE3)，为系统研究其结构与功能奠定基础。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 毕赤酵母菌株X33及载体pPICZαC购自Invitrogen公司(美国);工具酶、DNA分子量Marker购自Takara Biotech公司(日本);质粒提取试剂盒购自Omega公司(美国);琼脂糖DNA回收试剂盒、质粒提取和纯化试剂盒以及E.coli XL1Blue购自北京鼎国生物技术公司;小鼠抗人ApoE抗体购自Abcam公司(英国);辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠抗体购自北京鼎国生物技术公司;引物由上海生物工程公司合成，其余试剂均为分析纯。

　　1.2 方法

　　1.2.1 人肝组织RNA的提取 Trizol 法提取肝组织RNA。取1 μl 样品适当稀释后，用紫外分光光度计测定A260和A280,检测其浓度和纯度，琼脂糖凝胶电泳观察RNA 的完整性。

　　1.2.2 RTPCR扩增人ApoE3基因 以肝组织提取的总RNA作为RTPCR的模板。上游引物为5′AAACTCGAGAAGAGAAAGGTGGAGCAAGCGGTG3′;下游引物为5′AACGAATTCTCAGTGATTGTCGCTGGGCACAGG3′。它们分别含有内切酶XhoI和 EcoRI的识别序列。RTPCR的程序为：94℃变性4 min，42℃逆转录50 min，94℃变性2 min;94℃变性2 min，61℃退火30 s，72℃延伸1 min 30个循环;72℃再延伸10 min。扩增ApoE3基因。

　　1.2.3 表达载体pPICZα/hApoE3的构建 经琼脂糖凝胶电泳回收的PCR产物用XhoⅠ和EcoRⅠ消化，重组到表达载体pPICZα相应的内切酶部位，构建成表达质粒。此重组质粒转化大肠杆菌感受态XL1Blue，大量扩增，并用质粒快速提取试剂盒提取质粒用于核酸测序。

　　1.2.4 pPICZα/hApoE3质粒电转化毕赤酵母 X33 10～15 μg pPICZα/hApoE3质粒经SacI线性化，酚/氯仿抽提，乙醇沉淀后溶于10 μl水中。与80 μl新鲜制备的X33感受态混匀，转入1 cm电转化杯中于冰中放置5 min，用BIORAD电穿孔仪选择酵母参数转化X33，迅速加入1 ml冰冷的山梨醇，28℃保温1 h，取50 μl涂于含Zeocin的YPD固体培养基(100 μg/ml)，28℃保温2～3 d。

　　1.2.5 rhApoE3在毕赤酵母中的表达 挑取Zeocin抗性单克隆接种于BMGY培养基中，培养至OD600达2.0～6.0收集细胞，重悬于BMMY中，0.5%甲醇诱导表达，每24 h取样，沉淀提取酵母基因组DNA做PCR鉴定，上清用于SDSPAGE及Western印迹分析。

　　1.2.6 rhApoE3的Western印迹分析 将ApoE3表达阳性酵母菌株接种于1L摇瓶发酵，0.5%甲醇诱导，表达上清经过硫酸铵沉淀浓缩后，进行Western印迹分析〔7〕。

　　2 结 果

　　2.1 人胚胎组织RNA的提取 采用Trizol法从人肝组织中提取RNA，紫外分光光度法分析结果显示，A260/A280介于1.8～2.0之间，说明RNA 纯度较高。1.0%琼脂糖凝胶电泳可见28、18和5 S 3条清晰条带(图1)，说明RNA 完整性好。

　　1～2.Trizol 法提取的肝组织总RNA

　　图1 肝组织中提取RNA的琼脂糖凝胶电泳分析

　　2.2 RTPCR扩增人ApoE3基因 以肝组织RNA为模板，RTPCR 扩增ApoE3基因。经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，扩增出900 bp大小的条带(图2)，与人ApoE3 cDNA 大小一致。DNA测序结果表明，连接到pPICZα载体的ApoE3基因片段与GenBank上登录的序列完全一致。

　　2.3 rhApoE3在毕赤酵母中的表达 提取的酵母工程菌基因组DNA经PCR法扩增获得约900 bp的片段(图3)，而对照无此条带。上述结果证明hApoE3基因已整合入酵母菌X33的基因组中。将上述PCR结果阳性的酵母菌置于pH6.0的BMGY培养液中，0.5%甲醇诱导表达，每24 h取样，分离上清进行SDSPAGE分析，120 h后中止表达。SDSPAGE分析显示甲醇诱导后的发酵上清在还原条件下，在分子量约34 kD出现考马斯亮蓝染色条带，诱导表达72 h rhApoE3表达量达到高峰 (图4)。

　　2.4 rhApoE3的鉴定 SDSPAGE分析显示甲醇诱导后的发酵上清在分子量约34 kD 处出现考马斯亮蓝染色条带。Western印迹分析结果显示在相对分子量约34 kD处出现特异性条带(图5)。

　　3 讨 论

　　毕赤酵母表达系统兼有原核细胞良好的可操纵性及真核表达系统的高表达、高稳定及可进行蛋白质的加工、折叠、转录后修饰等优点〔8〕，表达载体通过同源重组将外源基因整合入酵母菌基因组而随同酵母菌的染色体一起复制。同源重组时，毕赤酵母表达质粒可通过体内和体外两种方式多拷贝的整合于毕赤酵母菌的基因组中，可显著增加外源蛋白的表达水平。

　　本实验应用基因重组技术，将hApoE3 cDNA重组到分泌型表达载体pPICZα，线性化后转化毕赤酵母感受态细胞，甲醇诱导表达，建立rhApoE3的毕赤酵母表达体系。重组蛋白的产量具有累积效应，表达第3天达到高峰。产物发酵后进一步应用免疫印迹方法进行鉴定，可见34 kD的位置出现染色条带，与天然hApoE3分子量相符。重组蛋白在α信号肽引导下分泌到培养基中，这不仅避免了产物被细胞内蛋白酶降解和因产物在细胞内堆积所造成的毒性作用而影响细胞代谢，而且大大简化了产物的分离纯化过程，为大规模生产提供了便利条件。本实验建立了rhApoE3在毕赤酵母中稳定、高效的表达体系，其产量可达150 mg/L。为开展hApoE3结构与功能的研究奠定了基础。

　　【参考文献】

　　1 Mahley RW,Rall SC.Apolipoprotein E：far more than a lipid transport protein.Annu Rev Genomics Hum Genet，2000;1(4):50737.

　　2 Utermann G,Hees M,Steinmetz A.Polymorphism of apolipoprotein E and occurrence of dysbetalipoproteinaemia in man〔J〕.Nature，1977;269(5629)：6047.

　　3 Davignon J，Gregg RE，Sing CF.Apolipoprotein E polymorphism and atherosclerosis〔J〕.Arteriosclerosis，1988;8(1):121.

　　4 Miller RM,Federoff HJ,Isoformspecific effects of ApoE on HSV immediate early gene expression and establishment of latency〔J〕.Neurobiol Aging，2008;29(1)：717.

　　5 Mahley.Apolipoprotein E：cholesterol transport protein with expanding

　　role in cell biology.Science，1988;240(4852):62230.

　　6 Kolovou G,Daskalova D.Apolipoprotein E polymorphism and atherosclerosis〔J〕.Angiology,2003;54(1):5971.

　　7 金冬雁，黎孟枫译.分子克隆实验指南〔M〕.第2版.北京：科学出版社，1992：1669.

　　8 Cereghino JL，Cregg JM.Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris〔J〕.FEMS Microbiol Rev，2000;24 ( 1 )：4566.