亚洲牛带绦虫TaCRISP基因克隆、表达和序列分析

　　　作者：戴鹏1，戴佳琳2，黄江2，廖兴江2 ，郎书源2，周灵贵2，申萍香2 作者单位：1.贵阳医学院理化实验中心，贵州 贵阳 550004; 2.贵阳医学院多媒体形态学实验室

　　【摘要】 目的 通过筛选亚洲牛带绦虫(Taenia saginata asiatica)成虫cDNA 质粒文库,识别半胱氨酸分泌蛋白(Ta CRISP),并进行克隆表达,为进一步研究其功能提供基础依据。方法 用生物信息学方法从亚洲牛带绦虫成虫全长cDNA质粒文库中识别TaCRISP的全长编码基因并预测编码蛋白质的各种结构与功能;将其编码区序列克隆到原核表达载体pET-30a(+)上,测序鉴定重组质粒,之后进行诱导表达,表达产物经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定。结果 该基因全长1 090bp,编码239个氨基酸,1aa-16aa位为分泌信号肽，理论分子量为26 973.8,等电点为5.96。生物信息分析揭示,Ta CRISP与中殖孔绦虫CRISP一致性为38%，相似性为54%;所构建的重组体经PCR、双酶切及测序鉴定与目标基因相符。SDS-PAGE结果表明，目的基因在大肠埃希菌BL-21/DE3中表达成功。结论 发现亚洲牛带绦虫Ta CRISP基因,成功构建重组原核表达质粒并表达出融合蛋白。

　　【关键词】 亚洲牛带绦虫;半胱氨酸分泌蛋白;分子克隆;原核表达;序列分析

　　Cloning,expression and sequence analysis of cysteinerich secretion protein 2 gene from Taenia saginata asiatica DAI Peng,DAI Jialin,Huang Jiang,et al.Physical and Chemical Experiments Center，Guiyang Medical College(Guiyang 550004，China)

　　Abstract： Objective To search and identify novel gene by screening the cDNA library of adult Taenia saginata asiatica,and to clone and express the gene so as to lay a foundation for the further study of Ta CRISP gene’s function.Methods By the bioinformatics analyzing tools in bioinformatics webs site，a Ta CRISP 2 fulllength gene from the Taenia saginata asiatica fulllength cDNA plasmid libratory was identified and the coding region sequence and the characteristics of the deduced protein were analyzed.The coding region of Ta CRISP was amplified with PCR,endonuclease digestion and cloned into the prokaryotic expression vector pET30a(+) and then expressed in E.coli BL21 with IPTG induction.The recombinant protein was detected by SDSPAGE.Results A novel cDNA sequence encoding Ta CRISP with a molecular mass of 26973.8 ,pI 5.96 ,which was 1090 bp and encoding 239 aa,and with 1aa to 16aa signal peptide,was found from the cDNA library of Taenia saginata asiatica.The recombinant plasmid pET30a(+)TaCRISP was constructed and expressed in fusion protein.Conclusion A novel gene encoding TaCRISP of Taenia saginata asiatica was identified and its prokaryotic expression vectors was expressed in fusion protein successfully.

　　Key words：Taenia saginata asiatic;cysteinerich secretion protein;molecular cloning;prokaryotic expression;sequence analysis

　　亚洲牛带绦虫(Taenia saginata asiatic)是一种介于猪带绦虫和牛带绦虫之间的人体带绦虫，其成虫特征几乎和牛带绦虫一致，但其中间宿主主要是猪，人因生食猪肝等内脏而感染〔1-3〕。近年来，本课题组在亚洲牛带绦虫和牛带绦虫的流行病学、分类学、生态学、发育生物学、组织病理学和免疫学等传统寄生虫学领域进行了研究，摸清了2种带牛绦虫在我国西部省区的分布情况和主要传播方式 〔4，5〕。2006年，在前期研究的基础上开启了对亚洲牛带绦虫功能基因组学的研究〔6〕。本研究通过筛选亚洲牛带绦虫成虫cDNA 质粒文库,寻找、识别出亚洲牛带绦虫CRISP (TaCRISP) 新基因,将其编码区克隆到原核表达质粒pET-30a(+) 中,并在大肠埃希菌BL-21/DE3中表达出融合蛋白,为进一步研究其功能提供基础依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 文库、质粒、菌株 虫体标本采自亚洲牛带绦虫流行区贵州省都匀市米秀乡，亚洲牛带绦虫成虫全长cDNA质粒文库的构建和标签(EST)测序及Unigene分析与上海联合基因有限公司合作完成。编码亚洲牛带绦虫CRISP基因文库质粒编号为Ta HC10-A11，接收登录号为EF420485。原核表达质粒pET-30a(+)和大肠埃希菌BL-21/DE3由中山医学院病原生物学实验室保存。

　　1.1.2 主要试剂和工具酶 Ex Taq酶(含dNTP)，NedⅠ，XhoⅠ，T4 DNA连接酶，DNA标准(DL 15，000;DL 2，000)(大连宝生物工程公司);异丙硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)(美国Promega公司);Ni-IDA Agarose(cat No：69670)(美国Novagen公司);蛋白分子量标准(立陶宛MBI公司);DNA凝胶回收试剂盒、质粒纯化试剂盒(北京赛百盛基因公司)。

　　1.1.3 引物合成和DNA测序 基因扩增引物和重组质粒DNA测序由Introvigen上海生物技术有限公司合成。

　　1.2 方法

　　1.2.1 Ta CRISP基因的识别 利用开放阅读框(ORF Finder)探寻器确定其完整编码序列并显示其编码的氨基酸序列。利用蛋白分析专家系统服务器ExPASy Proteomics Server (http://ca.expasy.org/) 所提供的蛋白质在线分析工具，如protparam (http://au.expasy.org/tools/protparam.html)预测氨基酸序列的分子量、等电点、稳定性指数等理化性质; InterPro Scan (http://www.ebi.ac.uk/InterProScan/)和MotifScan(http://myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan)预测氨基酸序列中的功能域。

　　1.2.2 CRISP基因的扩增 根据已获得的CRISP编码序列，利用DNAClub和PCRdesign去除信号肽设计引物。上游引物：AATCATATGGAAAGACCAACAGAGGCAGAACGC，带NedⅠ酶切位点;下游引物：AGCCTCGAGCTGAACAAGTAGGTAAACGATGAG，带Xho Ⅰ酶切位点。以亚洲牛带绦虫成虫cDNA文库中CRISP基因的克隆质粒为模版，94 ℃预变性5 min后，热循环参数为94 ℃ 1 min，61 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共35个循环，最后72 ℃延伸10 min。PCR产物1%琼脂糖凝胶电泳回收。

　　1.2.3 重组原核表达质粒的构建及鉴定 将PCR产物和原核表达质粒pET-30a(+)经NedⅠ，Xho Ⅰ双酶切后回收，连接，转化大肠埃希菌BL-21/DE3感受态细胞，卡那霉素筛选阳性克隆。对阳性克隆提取质粒进行PCR，双酶切和测序鉴定。

　　1.2.4 CRISP基因在大肠埃希菌BL-21/DE3中的诱导表达 取50 μl培养过夜的阳性克隆菌液，加入含有卡那霉素的5 ml LB培养基中(菌液/培养基为1/100)，37 ℃ 250 r/min振摇至A 600为0.4～0.6时 ，加入异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)至终浓度1 mmol/L，诱导表达5 h。离心收集菌体，在沉淀中加入100 μl上样缓冲液，煮沸5～10 min，13 000 r离心，1 min取上清10 μl进行十二烷基磺酸钠聚丙烯胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分析。

　　1.2.5 CRISP基因在大肠埃希菌BL-21/DE3中的表达 按照上述方法对阳性克隆进行大量诱导表达，离心收集菌体，按每g菌体加入4 ml结合缓冲液重悬菌体，冰上放置30 min后冰上超声裂解(功率150 W，持续1 s，停2 s，共15 min)，4 ℃ 13 000 r/min离心20 min，收集上清，取30 μl加入10 μl SDS-PAGE上样缓冲液处理样品，12%SDS-PAGE，考马斯亮兰R 250染色。

　　2 结 果

　　2.1 BlASTX分析结果 从BLASTX分析结果看，该基因与GenBank中殖孔绦虫(登录号为AAT74668)(CRISP)同源基因的一致性为38%，相似性为54%。比对结果，该克隆基因的5′端序列长于中殖孔绦虫CRISP完整编码序列,其最大的ORF就是其完整的编码区，该基因全长1 090 bp,编码区为153～870，编码239个氨基酸，在5′端和3′端都有非翻译区，1aa-16aa为信号肽,方框内是该蛋白CRISP-1和CRISP-2功能结构域的所在位置,为421:YYLQMVWGN;541:YLLTCAYTPPG，所以推测为亚洲牛带绦虫成虫CRISP的全长基因序列。

　　2.2 蛋白质的理化性质预测 亚洲牛带绦虫CRISP的理论分子量和等电点分别是26 973.8和5.96。假设形成3对二硫键时，280 nm处的摩尔消光系数为47 620 mol/cm,0.1% 浓度(1 g/L) 的Abs为1.765;假设二硫键全部打开时，280 nm处的摩尔消光系数为46 870 mol/cm 0.1% 浓度(1 g/L) 的Abs为1.738。当成熟肽N端的一个氨基酸为蛋氨酸时，在哺乳动物网状红细胞体外表达的半衰期为30 h,在酵母和大肠埃希菌中体内表达的半衰期分别>20和10 h。在溶液中的不稳定指数为37.92,低于域值40，在溶液中性质稳定。

　　2.3 亚细胞定位 通过蛋白分析专家系统服务器ExPASy Proteomics Server (http://ca.expasy.org/) 所提供的蛋白质在线分析该基因具分泌型信号肽，1aa-16aa 为信号肽位置。

　　2.4 InterPro Scan 扫描一级结构中包含的结构和功能域特征序列 该氨基酸序列中含有4个V5TPLIKE催化位点motif,并含有CRISP和SCP的功能域，推测其可能具有半胱氨酸分泌蛋白功能。

　　2.5 原核重组质粒的鉴定(图1) 将重组质粒进行PCR和双酶切鉴定，产物进行1%琼脂糖凝胶电泳。第1泳道是PCR产物，第2泳道是双酶切鉴定结果，在750～500 bp之间有一清晰的条带，与目的基因(719 bp)的大小基本相符，证明重组质粒构建成功。注：M：DNA 标准(DL2000);1：CRISP的 PCR 产物;2： pET-30a(+)-Ta CRISP的双酶切;3：pET-30a(+)-Ta CRISP重组质粒。

　　图1 重组质粒的PCR及双酶切鉴定图

　　2.6 蛋白表达结果(图2) 将构建好的重组质粒转化到E.coli BL-21/DE3中表达，SDS-PAGE电泳分析结果第4，5泳道所示，大约在30 kD左右处出现表达条带，与目的蛋白分子量基本相符。

　　3 讨 论

　　寄生虫的半胱氨酸蛋白酶(CRISP)是目前的研究热点，对它的研究不仅揭开了寄生虫与宿主相互作用机制，也为寄生虫的诊断和防治提供了新的思路〔7，8〕。本研究通过BLASTX从亚洲牛带绦虫cDNA文库中识别出了一个编码CRISP的全长基因，并通过生物信息学的方法对其所编码蛋白的结构和功能进行预测，该蛋白为分泌型蛋白，具分泌信号肽，并具有半胱氨酸蛋白所特有的SCP、CRISP-1和CRISP-2结构功能域，该基因与GenBank中殖孔绦虫( 登录号为AAT74668)CRISP同源基因的一致性为38%，相似性为54%，所以推测为半胱氨酸蛋白酶(CRISP)〔9，10〕。

　　本研究将亚洲牛带绦虫成虫CRISP克隆到原核表达质粒pET-30a(+)中，双酶切及DNA测序结果均表明，pET-30a(+)-Ta CRISP重组质粒构建成功。在大肠埃希菌BL-21/DE3中用IPTG诱导表达，表达产物通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行鉴定。SDS-PAGE结果表明，该蛋白在全菌和沉淀中都有表达，但在上清中未见表达，说明CRISP是包涵体蛋白，在今后的实验中可以通过破包涵体得到纯化蛋白。本研究为进一步研究亚洲牛带绦虫CRISP的生物功能及其该蛋白在诊断、药物及疫苗研究中的应用前景提供了线索。

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