人唾液CCL28与sIgA抗体分泌的相关性研究

　　 作者：郑燕 作者单位：医学院微生物学教研室， 山东 济南 250012

　　【摘要】 目的：探讨健康人唾液中粘膜相关上皮趋化因子CCL28与sIgA抗体分泌的关系。方法：收集非刺激性全唾液,用酶联免疫吸附试验(ELISA)定量检测唾液中CCL28的含量。速率散射比浊方法定量检测唾液中sIgA的含量。结果：42例健康人唾液中所含CCL28的浓度平均值为(70.70±40.91)ng/ml，sIgA的浓度平均值为(113.86±54.90)mg/L，两者之间存在线性正相关关系(r=0.540)。结论：粘膜上皮趋化因子CCL28对唾液中sIgA的分泌起促进作用。

　　【关键词】 唾液 分泌型免疫球蛋白A 粘膜相关上皮趋化因子

　　LI Xiao1, ZHENG Yan2, LI Dong1,　JIANG Guangshui1

　　(1. School of Stomotology; 2. Department of Microbiology, School of Medicine, Shandong University,

　　Jinan 250012, Shandong, China)

　　[ABSTRACT] Objective： To evaluate the correlation between the mucosal epithelial chemokine CCL28 and sIgA level in the saliva of healthy humans. Methods： Unstimulated whole saliva samples were collected. The CCL28 level was determined by ELISA.The salivary sIgA was measured by rate nephelometry assay. Results： In saliva samples of 42 healthy human beings, the mean value of salivary CCL28 was 70.70±40.91?ng/ml, and of salivary sIgA was 113.86±54.90?mg/L. A positive linear correlation was noted between CCL28 and sIgA in saliva (r=0.540). Conclusion： The mucosal epithelial chemokine CCL28 can promote the secretion of sIgA in saliva.

　　[KEY WORDS] Saliva; sIgA; CCL28 唾液中的分泌型IgA(sIgA)能够阻止病原生物在口腔中的粘附定植;因其本身的结构特点，sIgA对环境中的蛋白酶堆砌的分解破坏具有较强的抵抗能力，在保护口腔健康方面发挥着重要作用[1]。粘膜相关上皮趋化因子( mucosaeassociated epithelia chemokine ，CCL28/MEC)是一种近年来新发现的CC家族趋化因子。CCL28主要由粘膜上皮细胞表达, 通过与CCR10和CCR3受体结合发挥作用[2]。研究表明，CCL28与CCR1O结合可能与趋化吸引循环IgA浆细胞的归巢和迁移有关[3],在小鼠乳腺中CCL28能上调 IgA 抗体分泌细胞在此组织中聚集[4]。然而，对唾液中CCL28与sIgA的关系、以及与口腔健康状况的确切关系，迄今尚不明确。本研究通过探讨人唾液腺中CCL28与sIgA抗体分泌的相关性，旨在为口腔粘膜免疫机制的深入研究提供实验依据。

　　1 资料与方法

　　1.1 研究对象 选取山东大学在校大学生及研究生共42例，其中，女22例，男20例，年龄18 30岁。经检查，受试者均无口腔炎症表现。

　　1.2 标本采集 采用滴取法收集受试者非刺激性全唾液。唾液收集在早晨、空腹、安静房间里进行。嘱咐受试者用清水30?ml漱口以清除口腔内残渣，吐尽残留液体，5?min后使唾液自然流出。 收集其非刺激性全唾液2?ml于无菌平板培养皿中，而后迅速分装至无菌EP管中，立即置-20?℃保存待用。

　　1.3 材料 人CCL28夹心ELISA定量检测试剂盒，含有包被抗CCL28单克隆抗体的96孔平底板，辣根过氧化物酶(HRD)标记的抗人CCL28多克隆抗体，CCL28蛋白标准品及稀释液、显色液、终止液等，均为R&D System Inc.产品。

　　Dade Behring human IgA检测试剂盒，为Dade Behring Inc.产品。酶标仪(Model 680 Microplate Reader)为美国Biorad 公司产品;IMMAGE全自动免疫化学分析仪 (Beckman coulter immage immunochemistry system)为Beckman coulter公司产品。

　　1.4 唾液中CCL28的检测 采用夹心ELISA方法定量检测唾液中CCL28。操作过程严格按试剂盒要求进行。主要步骤如下：用试剂盒提供的稀释液按1∶100稀释唾液标本，而后将稀释后的唾液标本加入96孔平底板(100?μl/孔)，室温孵育1?h，冲洗板孔以除去未结合的抗原;加入辣根过氧化物酶标记的抗CCL28多抗(200?μl/孔)，室温孵育3?h，冲洗板孔;再加入底物四甲基联苯胺(200?μl/孔)，避光显色30?min;最后加入H2SO4(50?μl/孔)终止反应。酶标仪下450?nm处测吸光度(A)值。商品化可溶性人CCL28蛋白倍比稀释后作为标准品，绘制标准曲线。

　　1.5 唾液中sIgA的检测 应用美国Beckman公司全自动免疫化学分析仪和标准化试剂盒，速率散射比浊法定量检测唾液中sIgA，操作方法参照按仪器资料进行。

　　1.6 统计学处理 采用SPSS11.0软件进行统计学分析。人唾液中CCL28与sIgA含量以±s表示，并对二者行Pearson相关性分析。

　　2 结 果

　　2.1 唾液中CCL28及sIgA浓度测定结果 采用夹心ELISA方法及速率散射比浊方法分别对42例健康人唾液标本中的CCL28及sIgA进行检测。结果表明，42名健康人唾液中所含CCL28的浓度平均值为(70.70±40.91)ng/ml，所含sIgA的浓度平均值为(113.86±54.90)mg/L，均在正常范围内。

　　2.2 唾液中CCL28含量与sIgA抗体分泌的相关性 唾液中CCL28含量与sIgA抗体分泌的相关散点图及回归线见图1。经Pearson相关性分析，两者呈正相关(r=0.540),相应的回归系数具有显著的统计意义(P<0.001)。

　　3 讨 论

　　唾液腺是机体粘膜免疫系统的重要组成部分之一， 唾液腺间质内有淋巴细胞和浆细胞，浆细胞分泌的IgA与腺细胞产生的蛋白质分泌片结合，形成分泌性IgA，随唾液排入口腔，具有免疫作用。循环中的浆细胞在什么因子的作用下，穿越血管壁聚集到唾液腺的间质中尚不完全明确。近有研究报道，在引导循环中IgA分泌细胞跨出血管归巢迁移的过程中，粘膜上皮趋化细胞因子CCL28起了关键作用。Wilson 等[4]报道，小鼠乳腺中CCL28能上调IgA抗体分泌细胞在此组织中聚积，并增强母体sIgA抗体向子代的被动转移，提示小鼠乳腺中CCL28含量与sIgA抗体分泌有正相关性。在唾液腺中CCL28 mRNA也呈高水平表达[5]，但唾液中CCL28含量与sIgA抗体分泌的关系如何，目前尚无明确的研究结果。本研究应用夹心ELISA和速率散射比浊法分别检测了CCL28与sIgA在健康人群唾液中的含量，并探讨了二者的相关性。实验结果显示，健康人唾液中CCL28含量与sIgA分泌水平呈正相关的关系(r=0.540,P<0.001)，说明人唾液腺粘膜上皮细胞表达的CCL28对于sIgA分泌有促进作用，此结果支持Wilson等在小鼠乳腺中得出的结论。提示，人唾液中CCL28对于保持人群的口腔健康状态可能起到双重的免疫作用。一方面CCL28通过某种机制扩散移行至毛细血管后引导IgA分泌细胞归巢至涎腺实质组织，促进了局部sIgA的产生;另一方面CCL28可进入唾液发挥直接的抗微生物作用[5]。

　　本研究通过多次预试验发现，唾液中的CCL28蛋白很不稳定，对温度敏感，若在室温环境下放置较长时间(大于1?h)或反复冻融，其活性会大幅降低。故建议收集新鲜的唾液标本后置冰盒内立即检测或置-20?℃后尽早检测，并避免反复冻融标本;在-20?℃环境下冷冻时间过长亦会影响试验结果。本研究建立了人唾液中CCL28夹心ELISA测定方法，检测结果表明，健康人唾液中CCL28的浓度平均值为(70.70±40.91)ng/ml，此结果为进一步对口腔感染患者唾液中CCL28的研究提供了实验依据。最近，CCL28蛋白表达水平与支气管哮喘、结肠癌等疾病的关系已有研究报道[6,7]，唾液中趋化因子CCL28的生物功能以及与口腔疾病发生发展的关系有待进一步研究。

　　【参考文献】

　　[1] Marcotte H, Lavoie MC. Oral microbial ecology and the role of salivary immunoglobulinA[J]. Microbiol Mol Biol Rev, 1998, 62(1):71109.

　　[2] Pan J, Kunkel EJ, Gosslar U, et al. A novel chemokine ligand for CCR10 and CCR3 expressed by epithelial cells in mucosal tissues[J].J Immunol, 2000, 165(6):2?9432?949.

　　[3] Lazarus NH, Kunkel EJ, Johnston B, et al. A common mucosal chemokine (mucosaeassociated epithelial chemokine/CCL28) selectively attracts IgA plasmablasts[J]. J Immunol, 2003, 170(7):3?7993?805.

　　[4] Wilson E, Butcher EC. CCL28 controls immunoglobulin (Ig)A plasma cell accumulation in the lactating mammary gland and IgA antibody transfer to the neonate[J]. J Exp Med, 2004, 200(6):805809.

　　[5] Hieshima K, Ohtani H, Shibano M, et al. CCL28 has dual roles in mucosal immunity as a chemokine with broadspectrum antimicrobial activity[J]. J Immunol, 2003, 170(3):1?4521?461.

　　[6] English K, Brady C, Corcoran P, et al. Inflammation of the respiratory tract is associated with CCL28 and CCR10 expression in a murine model of allergic asthma[J]. Immunol Lett, 2006, 103(2):92100.

　　[7] Dimberg J, Hugander A, Wagsater D. Protein expression of the chemokine, CCL28, in human colorectal cancer[J]. Int J Oncol, 2006, 28(2):315319.