ESA和STAg鼻内免疫小鼠抗弓形虫感染作用

　　 作者：杨晓红，吴静，殷国荣，刘娟娟，孟晓丽，申金雁 作者单位：1.山西医科大学医学寄生虫学研究所，太原 030001; 2.山西职工医学院寄生虫学教研室

       【摘要】 目的 观察弓形虫速殖子排泄一分泌抗原(excreted/secreted antigen，ESA)和可溶性速殖子抗原(soluble tachyzoite antigen，STAg)鼻内免疫小鼠诱导的抗弓形虫感染作用。方法 BALB/c小鼠64只随机分为4组，每组16只，分别用磷酸盐缓冲液(PBS)(对照组)20 μl/只、体外排泄-分泌抗原(excreted/secreted antigen in vitro，ESAv)20 μg/只、腹腔排泄-分泌抗原(excreted/secreted antigen in mice，ESAm)20 μg/只和STAg20 μg/只滴鼻免疫小鼠2次，间隔14 d。末次免疫后14 d每组处死8只小鼠，ELISA法检测血清IgG和小肠冲洗液sIgA。每组剩余8只小鼠用RH株弓形虫速殖子1×104个/只灌胃攻击，记录小鼠健康情况。攻击后30 d处死小鼠，计数脾、脑组织内弓形虫虫荷(速殖子数)。结果 ESAm组小鼠于2次免疫后出现轻微竖毛、倦怠等症状，其他各组小鼠健康状况良好。免疫后14 d，各抗原组血清IgG水平均明显高于对照组(P<0.001);ESAv(P<0.05)、ESAm(P<0.001)和STAg(P<0.001)组肠液sIgA水平明显高于对照组，EsAm(P<0.001)和sTAg(P<0.05)组高于EsAv组。弓形虫攻虫后：30 d，各抗原组小鼠脾、脑组织内虫荷显著低于对照组(P<0.01)，ESAv、ESAm和sTAg组脾内速殖子减虫率分别为49.2%，49.52%和51.94%，脑内减虫率分别为46.83%，50.81%和51.18%。结论 ESAv、ESAm和STAg鼻内免疫均能产生抗弓形虫感染的部分保护，但ESAm可能对机体有毒副作用，不适宜直接鼻内免疫。

　　【关键词】 刚地弓形虫;排泄-分泌抗原;可溶性速殖子抗原

　　Intranasal immunization with ESA and STAg protects mice against Toxoplasma gondii infection YANG Xiaohong,WU Jing,YIN Guorong,et al.Institute of Medical Parasitology,Shanxi Medical University(Taiyuan 030001,China)

　　Abstract： Objective To study the protective immunity against Toxoplasma gondii induced by intranasal immunization with excreted/secreted antigens (ESA) and soluble tachyzoite antigen (STAg) in mice.Methods Sixtyfour BALB/c mice were randomly divided into four groups.The control group was intranasally treated with 20 μl PBS per mouse and the test groups treated with 20 μg ESA in vitro(ESAv),ESA from peritoneal fluids(ESAm) or STAg per mouse,respectively,twice at an internal of 2 weeks.Eight mice of each group were killed on day 14 th after the last immunization.Serum IgG and slgA in intestinal washes were detected by ELISA.Eight mice were challenged intragastrically with 1×104 tachyzoites per mouse on day 14 th after the last immunization.Mice were killed on the 30th day after the challenge,the tachyzoites in their spleens and brains were counted.Results Mice in ESA from peritoneal fluids group appeared slight piloerection and lassitude,while mice in other groups were healthy.The level of serum IgG in all antigen groups was higher than that of PBS group on 14 day after immunization(P<0.001).The levels of slgA in ESAv group(P<0.05),ESAm group(P<0.001) and STAg group (P<0.001) was higher than that of PBS group,and the levels in ESAm group (P<0.001) and STAg group (P<0.05) were higher than that of ESAv group.The tachyzoite load in spleens and brains in all antigen groups was significantly lower than that of PBS group (P<0.05).Compared with PBS group,The tachyzoite load in spleens of ESAv group,ESAm group and STAg groupd decreased with a percentages of 49.2%,49.52% and 51.94% in the spleens,respectively,and 46.83%,50.81% and 51.18% in the brains,respectively.Conclusion Intranasal immunization with ESA in vitro，ESA from peritoneal fluids or STAg can effectively induce immune responses against Toxoplasma gondii.ESA from peritoneal fluids has toxic side effect on mice.ESA in vitro and STAg may be attractive candidate for Toxoplasma gondii vaccine.

　　Key words： Toxoplasma gondii;excreted/secreted antigen;soluble tachyzoite antigen

　　弓形虫是一种专性细胞内寄生原虫，可感染人和温血动物。弓形虫抗原表达具有特异性，某个阶段抗原所诱导的保护性免疫并不完全，融合多个保护性抗原的复合疫苗可克服这个缺陷。目前，研究最多的弓形虫抗原为排泄-分泌抗原(excreted/secreted antigen，ESA)和可溶性速殖子抗原(soluble tachyzoiten,STAg)。用STAg联合包囊抗原免疫小鼠，可明显提高P株包囊攻击鼠的存活率，减少脑内包囊数〔1〕。本实验用体外培养弓形虫速殖子排泄-分泌抗原(excreted/secreted antigen in vitro，ESAv)、小鼠腹腔来源排泄-分泌抗原(excreted/secreted antigen in mice，ESAm)和STAg鼻内免疫小鼠，观察抗原诱导的抗感染保护作用，旨在为弓形虫复合黏膜疫苗的研制筛选抗原。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物及虫株 BALB/c小鼠(中国医学科学院实验动物研究所)，二级动物室内近交繁殖。国际标准强毒RH株弓形虫(本实验室液氮保种)。常规复苏速殖子，腹腔接种BALB/c小鼠转种3代，收集腹腔冲洗液，洗涤净化后计数速殖子，2%台盼蓝染色观察速殖子活力，用RPMl 1640培养液调整速殖子浓度为2×106/ml，用于制备ESAv、ESAm和STAg。

　　1.2 细胞株及其培养 非洲绿猴肾细胞株(Vero)(本实验室保存)。常规复苏Vero细胞，37 ℃、5% CO2、RPMI 1640培养液(含10%的胎牛血清、青霉素100 U/ml、链霉素100 μg/ml)培养，pH 7.2。

　　1.3 ESA的制备 (1)ESAv的制备：将弓形虫速殖子悬液2×106/ml加入Vero细胞培养瓶中，置含1%胎牛血清的RPMI 1640培养基、37 ℃、5% CO2共培养12 h后弃去培养上清液，磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗1次，然后加入不含血清的RPMI 1640培养基继续培养，第13 d收集培养上清液，1500 r/min离心10 min，取上清液，镜检无速殖子和Vero细胞，即为ESA。考马斯亮蓝法测定蛋白含量，-20 ℃保存。(2)ESAm的制备：小鼠腹腔接种5000个纯化的速殖子，48 h后，用无菌0.05 mol/L pH 7.2的PBS腹腔灌洗法收集腹腔液，4 000r/min离心45 min，吸取上清液，镜检无速殖子和小鼠腹腔细胞，-20 ℃过夜，次日室温融化，4 000 r/min离心30 min，弃自凝物后，10 000 r/min 4 ℃离心60 min，上清液为弓形虫ESA。考马斯亮蓝测定蛋白含量，-20 ℃保存。

　　1.4 STAg的制备 按文献〔2〕方法，小鼠腹水分离净化的弓形虫速殖子沉淀物，冰浴中超声粉碎，-20 ℃反复冻融，10 000 r/min 4 ℃离心30 min，上清液即为STAg。考马斯亮蓝法测定STAg蛋白含量，-20 ℃保存。

　　1.5 动物分组与处理 5～6周龄BABL/c小鼠64只，雌雄各半，随机分为对照组、ESAv组、ESAm组和STAg组，每组16只。分别用PBS 20 μl/只，ESAv 20 μg/只、ESAm/只或STAg/只鼻内免疫2次，间隔14 d。逐日观察小鼠健康状况。末次免疫后第14d每组颈椎脱臼处死8只小鼠，摘眼球采血常规分离血清;开腹游离小肠，剪取幽门至回盲部小肠段，置于平皿内，用3 ml PBS反复冲洗肠腔3次，收集小肠冲洗液，2 500 r/min离心10 min，取上清;每组剩余8只小鼠用弓形虫RH株速殖子1×104个/只灌胃攻击，观察小鼠健康及死亡情况并记录体重，攻击后30 d处死小鼠，计数脾、脑组织内弓形虫虫荷(速殖子数)。

　　1.6 弓形虫特异性抗体测定 按文献〔3〕法，ELISA法检测血清IgG(待测血清样品用样本稀释液1：50稀释)、肠道sIgA。以质量比1：1：1混合ESAv、ESAm和STAg(1：100稀释)包被酶标板。测定吸光度(A492)值。

　　1.7 组织内弓形虫速殖子分离计数 攻击感染后第30d处死小鼠，摘取脾、脑，按文献〔4〕制备组织匀浆，计数组织内速殖子数，计算每克组织速殖子数和减虫率。

　　1.8 统计分析 采用SPSS13.0统计软件进行分析，组间比较采用单因素方差分析。

　　2 结 果

　　2.1 小鼠健康状况及体重变化 免疫后，ESAm组小鼠于2次免疫后出现轻微竖毛、倦怠，眼结膜和鼻腔黏膜有轻微充血，其他各组小鼠精神状态良好，饮水及采食均正常。攻击后第8 d，对照组小鼠出现竖毛、倦怠、活动减少，随后出现腹部塌陷、饮水及采食减少，眼结膜充血等异常表现，攻击后第9和第10 d分别死亡1只，第11 d死亡2只;第16 d症状有所减轻，至处死时部分小鼠仍有竖毛。ESAv组小鼠整个实验过程中未见明显异常表现，无死亡。ESAm组小鼠于2次免疫后出现上述异常表现，攻击后11 d症状有所加重，第23 d后有所缓解;16，18 d各死亡1只。STAg组小鼠于攻击后第10 d出现竖毛等异常表现，但症状轻微;第13 d死亡1只。攻虫后对照组小鼠体重逐渐下降，15 d之后逐渐趋于平缓，ESAv(P<0.05)和STAg(P<0.05)组小鼠体重仍呈增高趋势，ESAm组体重未见明显增加。

　　2.2 小鼠组织内虫荷(速殖子数) 攻虫后30 d，ESAv、ESAm和STAg免疫组脾(F=9.997，P<0.01)、脑内(F=6.395，P<0.01)虫荷均显著低于对照组，各抗原组间差异无统计学意义(P>0.05)。与对照组比较，ESAv、ESAm和STAg组脾内速殖子数分别减少了49.2%，49.52%和51.94%，脑内减虫率分别为46.83%，50.81%和51.18%。

　　2.3 血清IgG、肠液sIgA水平(表1) 免疫后14d，各抗原组血清IgG均显著高于对照组(F=4.959，P<0.001)，抗原组间无差异;肠液sIgA水平，免疫后14d，ESAv(P<0.05)、ESAm(P<0.001)和STAg(P<0.001)组均高于对照组(F=16.141);抗原组间比较，ESAm组(P<0.001)和STAg组(P<0.05)高于ESAv组，ESAm和STAg组间差异无统计学意义。表1 弓形虫不同抗原免疫小鼠血清IgG和肠液sIgA水平注：与对照组比较，* P<0.05，** P<0.01;n=8。

　　3 讨 论

　　本实验结果显示，ESAm组小鼠在2次免疫后出现轻微竖毛、倦怠，眼结膜和鼻腔黏膜有轻微充血，这可能与从感染鼠腹水中提取的ESA中存在弓形虫毒素(Toxotoxin)有关。Toxotoxin是虫体在发育增殖过程中产生的毒性物质，可使宿主肝、脾、神经系统等受到损害，甚至引起死亡。本实验中ESAv及STAg免疫小鼠后未出现明显的异常表现，无明显肉眼可见的病理改变，鼻内接种20μg STAg或ESAv对小鼠是安全的。

　　疫苗有效性的评估主要包括2个方面：接种抗原后免疫应答的产生情况及抗感染的保护率。本实验通过观察不同抗原鼻内免疫对速殖子攻击后小鼠体重及组织内虫荷的的检测发现，对照组小鼠体重逐渐降低，ESAv和STAg免疫组小鼠体重不受攻击影响，而ESAm组体重未见明显增加，这可能与攻击前该组小鼠的基础状态较差有关。攻击后30 d，各抗原免疫组小鼠脾、脑内虫荷明显减少，说明ESAv、ESAm和STAg均能有效保护小鼠抵抗弓形虫感染。ESAv、ESAm和STAg的滴鼻免疫可能触发了肠道相关淋巴细织(Gut-associated lymphoid tissue GALT)黏膜部位及系统的免疫应答，使得在弓形虫经口攻击后，GALT能有效地减少速殖子侵入肠道黏膜表面，阻止速殖子在肠上皮细胞内的繁殖，降低速殖子侵入循环系统播散至全身的机会〔4，5〕，同时激发的系统免疫应答也能降低进入循环系统的速殖子在全身致病〔6〕，从而使免疫鼠体重不受攻击影响，脏器内虫荷明显低于对照组。

　　保护性免疫还需要产生大量抗体，以便及时阻止一些病原体的传染途径。弓形虫复合黏膜疫苗鼻内免疫小鼠可诱导产生高水平的弓形虫特异性抗体，包括肠道slgA和血清IgG。本实验用弓形虫的不同抗原免疫小鼠后均产生了大量抗弓形虫的肠道slgA和血清IgG。用弓形虫速殖子攻击感染后，使免疫组小鼠获得高水平的保护性，脾、脑内虫荷明显低于对照组。ESAv、ESAm和STAg鼻内免疫均可有效产生抗弓形虫感染的部分免疫保护，但ESAm可能对机体有毒副作用，ESAv和STAg符合疫苗设计的安全性及有效性原则，可用于弓形虫复合黏膜疫苗的研制。

　　【参考文献】

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