分泌型人IL1β表达载体的构建及在H7402细胞中的表达

　　　作者：肖伟玲,林亚杰,牟东珍,孙萍,梁淑娟 作者单位：潍坊医学院免疫学重点实验室, 山东 潍坊 261042

　　【摘要】 目的 构建经典途径分泌型人白细胞介素1β(shIL1β)重组表达载体,检测其在H7402肝癌细胞中的表达。方法 采用SOE方法将人红细胞生成素(EPO)信号肽序列和编码人白细胞介素(hIL1β)成熟蛋白的基因序列拼接形成融合基因,与pIRES2EGFP质粒重组构建shIL1β真核表达载体pIRES2EGFPshIL1β,利用jetPEI方法将其稳定转染H7402细胞(H7402/shIL1β),荧光显微镜及RTPCR检测融合基因的表达水平,间接ELISA方法测定培养上清hIL1β分泌水平。结果 荧光显微镜下观察可见H7402/shIL1β细胞发出明亮绿色荧光,RTPCR检测显示pIRES2EGFPshIL1β能够在H7402细胞中稳定表达融合基因mRNA,同时细胞培养上清中hIL1β表达水平明显上升。结论成功构建了经典途径分泌的hIL1β重组表达载体,该载体可在H7402细胞中稳定分泌生物活性的hIL1β。

　　【关键词】 人白细胞介素1β;分泌表达;肝癌细胞;信号肽

　　XIAO Weiling, LIN Yajie, MU Dongzhen，SUN Ping, LIANG Shujuan

　　(1. Key Laboratory of Molecular Immunology, Weifang Medical College, Weifang 261042, Shandong, China;

　　2. Qilu Hospital of Shandong University, Jinan 250012, China)

　　To construct a classical pathway expressing secretory human interleukin 1 beta (shIL1β) recombinant vector and to analyze its expression level in H7402 hepatoma cells. Methods The total RNA was isolated from LPS stimulated healthy donor PBMCs, and the full length human interleukin 1 beta(hIL1β) gene was obtained by RTPCR. The human EPO signal peptide gene was prepared by primer overlapping extension, and fusion gene encoding both the EPO signal peptide and mature IL1β protein was synthesized through gene splicing by over lap extension(SOE). The product was directly cloned into pIRES2EGFP to construct the recombinant eukaryotic expression vector pIRES2EGFPshIL1β which was verified by PCR, restriction enzyme assay(BamH I and EcoR I) and DNA sequencing. Purified pIRES2EGFPshIL1β was stably transfected into the H7402 hepatoma cells by jetPEI, then the expression of the recombinant vector was verified under fluorescence microscopy, and the level of fusion gene mRNA was determined by RTPCR and of hIL1β in cellular supernatant was assessed by ELISA. Results The expression vector pIRES2EGFPshIL1β that could induce the expression of hIL1β was successfully prepared through the conventional protein secretory pathway. After the recombinant vector was transfected and selected with G418, the human H7402/shIL1β cells could effectively express the fusion gene mRNA, and the active hIL1β in the cellular supernatant was also significantly increased compared with the H7402/mock cells. Conclusion The recombinant pIRES2EGFPshIL1β vector that could express hIL1β was successfully established through the conventional protein secretory pathway.

　　Key words: Human interleukin 1 beta; Secretion expression; Hepatoma; Signal peptide

　　白细胞介素1β(IL1β)属于促炎性细胞因子,在介导急慢性炎症反应中发挥重要作用[12]。近年来越来越多的资料证实,该因子还参与多种肿瘤的发生和肿瘤血管形成等恶性过程[35]。在形成具有生物学活性的分子之前,IL1β前体蛋白需经IL1转化酶(ICE)降解,形成17?kD的成熟多肽并转运至细胞外环境,执行IL1β的生物学功能[6]。本研究将具有较强分泌功能的人红细胞生成素(EPO)信号肽与人白细胞介素1β(hIL1β)成熟蛋白基因融合,构建由经典途径分泌的(shIL1β)真核表达载体,将其导入人肝癌细胞H7402中分析其表达水平,目的是尽量降低ICE的限速作用,为研究hIL1β在肿瘤形成中的作用建立可靠的细胞模型。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　工程菌E.coli DH5α、质粒pIRES2EGFP,本室保存;研究所用引物由大连宝生物工程公司合成。TaqDNA聚合酶等工具酶、DNA Marker购自美国Promega公司。DMEM培养基购自美国Gibco公司;新生牛血清购自杭州四季青生物制品公司;G418为美国Invitrogen公司产品。hIL1β间接ELISA法检测试剂盒系R&D公司产品。

　　1.2 方法

　　1.2.1 人外周血单个核细胞的分离及细胞总RNA的提取

　　密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞(PBMC),LPS(5?μg/mL)刺激4?h,TRIzol法提取细胞总RNA,用于扩增hIL1β成熟蛋白的编码基因。

　　1.2.2 RTPCR扩增hIL1β成熟蛋白编码基因

　　扩增hIL1β的引物为:上游引物P1:5′GCACCTGTACGATCACTG 3′,下游引物P2:5′CGG*GATCCTTACGAAGACACAAATTG 3′(含BamH I酶切位点),为降低错配将GGA同义突变为CGA。反应条件:95?℃ 5?min，94?℃ 30?s,57?℃ 30?s,72?℃ 40?s,共30个循环,最后72?℃延伸10?min,预期产物长度为470?bp。

　　1.2.3 引物重叠延伸合成EPO信号肽序列

　　扩增人EPO信号肽的引物为:P3(bp):5′ CGG*AATTCACCATGGGGGTGCACGAATGTCCTGCCTGGCTGTGGCTTC

　　TCCTGTCCCTGC 3′ (G*AATTC为EcoR I位点,在ATG起始密码前引入ACC使之形成Kozak序列);P4(bp):5′ CAGTGATCGTACAGGTGCGCCCAGGACTGG

　　GAGGCCCAGAGGGAGCGACA GCAGGGACAGGA 3′为引物间的互补序列,通过引物重叠延伸得到EPO信号肽序列。P4引物5′端有与hIL1β成熟蛋白编码基因的前18个碱基即P1引物互补的序列。反应条件为:95?℃ 5?min;94?℃ 15?s,57?℃ 15?s,72?℃ 15?s,共25个循环;最后72?℃延伸7?min,预期片段长度为110?bp。

　　1.2.4 SOE法制备EPO信号肽与hIL1β融合基因

　　利用重叠延伸PCR(SOE)技术将EPO信号肽与hIL1β基因融合。上述EPO信号肽和hIL1β PCR产物纯化后,按照1∶1的比例加入反应体系中进行PCR,反应条件为:95?℃ 5?min;94?℃ 1?min,57?℃ 1?min,72?℃ 1?min,共15个循环。上述PCR产物中加入引物P3和P2,同上条件再反应30个循环,最后72?℃延伸10?min。1.5%琼脂电泳分析,观察结果。

　　1.2.5 分泌型真核重组质粒的构建

　　分别将EcoR I和BamH I双酶切后的SOE产物和pIRES2EGFP纯化、回收,在T4连接酶作用下22 ℃连接1 h,产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,挑取单菌落培养,菌落PCR初步鉴定,随后提取质粒进行EcoR I+BamH I限制性酶谱分析,最后通过DNA测序分析,确认获得shIL1β表达载体pIRES2EGFPshIL1β。

　　1.2.6 H7402肝癌细胞的稳定转染和阳性克隆筛选

　　将5×104/孔H7402肝癌细胞接种于24孔培养板,按照说明配制好质粒与jetPEI混合物,加到细胞中。实验分为3组:转染pIRES2EGFPshIL1β(H7402/shIL1β)的实验组,转染pIRES2EGFP(H7402/mock)的对照组,转染等量生理盐水的H7402细胞。转染后48?h,激光扫描共聚焦显微镜下观察重组载体的表达;72?h后按1∶10比例传代,加入含600?μg/mL G418的完全DMEM培养基,2周时H7402细胞全部死亡,逐渐增加G418浓度至1?mg/mL。利用原位胰蛋白酶消化法挑取单个克隆细胞,转移至24 孔板中,继续加入含1?mg/mL G418的培养基维持筛选2周,待克隆长成后收集细胞及上清进行鉴定并分析。

　　1.2.7 RTPCR分析转染细胞中融合基因的表达

　　收集2×106个H7402/shIL1β、H7402/mock细胞,提取总RNA,利用P2和P3引物进行RTPCR,检测融合基因的表达水平。

　　1.2.8 间接ELISA法检测细胞培养液上清中IL1β的水平

　　收集H7402/shIL1β和H7402/mock细胞培养上清,浓缩20倍后按试剂盒说明书的要求,取100?μL?上清加入96孔板中,设立三复孔,4?℃包被过夜,洗涤后分别加入第一抗体(兔抗人IL1β抗体)、第二抗体(HRP标记山羊抗兔抗体),37?℃各反应1?h,充分洗涤后加入DAB显色液,室温显色20?min,加入终止液,酶标仪490?nm处检测吸光度(OD)。

　　1.3 统计学处理

　　采用配对t检验,应用SPSS10.0软件进行数据处理,数据以±s表示。

　　2 结 果

　　2.1 人EPO信号肽与hIL1β融合基因的合成

　　利用引物重叠延伸的方法获得一长度约110?bp的人EPO信号肽序列,从人PBMCs总RNA中扩增得到一470?bp的hIL1β成熟蛋白编码基因片段。分别以上述两种产物为模板,进行SOEPCR,获得的基因产物大小约562?bp,与预期的融合基因长度相同(见图1)。

　　2.2 shIL1β重组表达载体的构建及鉴定

　　融合基因的PCR产物回收纯化后,与pIRES2EGFP真核表达载体分别进行EcoR I+BamH I 限制性酶切,将纯化的目的基因酶切片段和表达载体酶切片段进行连接,首先进行菌落PCR鉴定,随后提取质粒进行EcoR I、BamH I?限制性酶谱分析,切出一大小约556?bp的DNA片段,与预期产物长度相符(见图2)。经DNA序列分析证实,获得的融合基因序列与GeneBank中登录的EPO信号肽和hIL1β成熟蛋白编码基因完全一致,确认成功构建了hIL1β真核表达载体pIRES2EGFPshIL1β。

　　2.3 重组载体在H7402细胞中的稳定转染及表达

　　利用jetPEI将pIRES2EGFPshIL1β质粒转染至H7402细胞中,48?h后荧光显微镜下观察,可见转染细胞发出明亮绿色荧光(见图3)。G418筛选后获数个稳定转染的细胞克隆,提取细胞总RNA,RTPCR分析表明,H7402/shIL1β细胞能够持续表达高水平的融合基因,证明该重组表达载体已经稳定转染至H7402细胞中并能有效的表达融合基因(见图4)。

　　2.4 H7402/shIL1β上清中hIL1β的表达水平

　　利用间接ELISA的方法鉴定该分泌型载体在H7402细胞中的表达效率。研究结果显示,与H7402/mock细胞相比,H7402/shIL1β细胞培养上清中hIL1β的表达水平明显升高(见图5),差异有统计学意义(P<0.05),证实该载体能够有效地由经典途径分泌表达hIL1β活性蛋白。

　　3 讨 论

　　IL1β是较早发现的白细胞介素,和TNFα、IL6等共同组成促炎性细胞因子超家族,最初被认为主要介导机体炎症反应,调节免疫应答,在抗感染防御中发挥重要作用。近年来许多研究表明,IL1β的功能呈现多样性,除参与炎性反应外,还具有促进肿瘤血管生成,参与肿瘤生长和转移的作用,体内多种浸润性肿瘤中都发现了IL1β的作用[78]。

　　IL1β与其他大多数细胞因子不同,其基因中不含信号肽序列,因此不能通过经典的高尔基体内质网途径分泌。IL1β编码基因首先指导合成一个约33?kD的无活性前体蛋白(proIL1β),随后在IL1转换酶(ICE,即caspase1)作用下裂解成为17?kD左右的成熟蛋白,通过胞吐作用释放至细胞外,发挥IL1β的生物学功能,因此IL1β属于非经典途径分泌的蛋白质[9]。鉴于IL1β的分泌效率可能受到ICE活性的限速,为了获得能够高效表达的IL1β重组载体,建立可供研究的细胞模型,本研究尝试通过拼接信号肽的方法,引导IL1β通过经典途径分泌表达,从而尽量降低ICE的限速作用。

　　经典途径分泌的细胞因子其基因序列中都含有前导的信号肽序列,可引导蛋白质经由高尔基体-内质网途径分泌。信号肽序列在结构、功能及切割位点上都具有一定的相似性,虽然不同分泌型蛋白质的氨基酸序列存在很大差异,但其信号肽可以相互交换,并不影响正常的蛋白转运功能。本实验利用重叠引物延伸的方法扩增获得分泌功能强大的人EPO信号肽,通过SOE技术实现了EPO信号肽与hIL1β成熟蛋白编码基因的精确融合。与传统的DNA重组技术相比,本实验利用SOE技术合成融合基因,不需要使用限制性内切酶和连接酶,可避免引入限制性酶切位点的核苷酸序列等问题,是构建融合基因的一种新型高效的技术手段。但是融合基因能否有效地表达,是制约细胞模型建立的关键因素。本研究结果表明,转染后的H7402细胞可以稳定的表达融合基因mRNA,在H7402/shIL1β上清中,具有生物活性hIL1β的分泌水平明显升高,提示重组后载体能够在EPO信号肽的引导下使hIL1β通过经典途径进行分泌。本实验通过筛选获得的H7402/shIL1β细胞,为研究hIL1β在肝癌形成中的作用提供了重要的细胞模型,为抗炎治疗提供了重要的研究平台。

　　【参考文献】

　　[1]Dinarello C A. The IL1 family and inflammatory diseases[J]. Clin Exp Rheumatol, 2002, 20(5 Suppl 27):S113.

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　　[4]Apte R N, Krelin Y, Song X, et al. Effects of microenvironmentand malignant cellderived interleukin1 in carcinogenesis, tumour invasiveness and tumourhost interactions[J]. Eur J Cancer, 2006, 42(6):751759.

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　　[6]Greten F R, Arkan M C, Bollrath J. NFkappaB is a negative regulator of IL1beta secretion as revealed by genetic and pharmacological inhibition of IKK beta[J]. Cell， 2007, 130(5):918931.

　　[7]Basak C, Pathak S K, Bhattacharyya A. NFkappaBand C/EBPbetadriven interleukin1beta gene expression and PAK1mediated caspase1 activation play essential roles in interleukin1beta release from Helicobacter pylori lipopolysaccharidestimulated macrophages[J]. J Biol Chem, 2005， 280(6):42794288.

　　[8]Newton R, Holden N S, Catley M C. Repression of inflammatory gene expression in human pulmonary epithelial cells by smallmolecule IkappaB kinase inhibitors[J]. J Pharmacol Exp Ther， 2007， 321(2):734742.

　　[9]Nickel W. The mystery of nonclassical protein secretion. A current view on cargo proteins and potential export routes[J]. Eur J Biochem, 2003, 270(10):21092119.