胰岛移植的研究进展

　　作者：方兆东，马宁宁 作者单位：1.广西中医学院附属瑞康医院内分泌科，广西南宁530011;2.广西中医学院2006级研究生2班，广西南宁530001

　　【关键词】 胰岛移植 糖尿病

　　糖尿病是由多种原因引起的胰岛β细胞功能减退或衰竭，导致胰岛素绝对或相对不足，机体出现糖代谢紊乱，进而造成全身多器官损害的一种内分泌代谢性疾病。几乎所有1型糖尿病和部分2型糖尿病患者都需要应用外源性胰岛素注射来控制血糖，给患者的生活带来极大的不便。自人们开展首例人类胰岛移植以来，随着胰岛分离和纯化技术的不断改进以及Edmonton方案[1]的诞生，使胰岛移植技术在临床应用推广成为现实，但依然面临着巨大的挑战。笔者就胰岛移植的相关研究进展综述如下。

　　1 胰岛移植发展过程

　　胰腺器官移植虽然可以有效地控制血糖代谢提高生活质量，由于供体的匮乏和手术创伤的缺陷，使其应用受到极大限制。而胰岛移植技术简便安全，并发症少，可重复移植，免疫抑制剂用量小，可达到胰腺移植相似的治疗效果，易于临床治疗推广。

　　1894年，英国医生Williams和Harsant采用部分羊胰腺成分移植到皮下的方法治疗1例发生了酮症酸中毒的15岁1型糖尿病少年。虽然移植物发生排异而很快失效，但开创了胰岛移植的历史。1976年胰岛移植应用于临床，20世纪80年代，胰岛分离和纯化技术出现飞跃发展。2000年，加拿大Edmonton Alberta University的James Shapiro领导的研究小组探索的胰岛移植方案(Edmonton方案)取得了重大成功[1]。他们对7例有严重低血糖史和代谢不稳定的1型糖尿病患者成功进行了胰岛移植，随访平均11.9个月，术后均不需胰岛素治疗，未再发生严重低血糖。2004年美国糖尿病学会年会公布的国际多中心临床研究结果显示：应用Edmonton方案，胰岛移植3年以上不使用外源性胰岛素者达53%[2]。

　　目前，国内多家医院开展了胰岛移植。其中，中南大学湘雅三医院王维先后进行了二十多例同种和异种胰岛移植，取得了明显效果[3]。

　　2 胰岛细胞的来源

　　供体来源主要为同种胰岛和异种胰岛。成人胰腺、胚胎胰腺以及新生儿胰腺均是同种胰岛的主要来源。理想胰腺供体应该是来自脑死亡志愿捐献者心脏停搏前的健康胰腺。成人尸体胰腺与死婴胰腺相比可供分离的胰岛虽然较多，分泌胰岛素稳定，但成人胰岛免疫原性强，耐免疫排斥差，需终生采用免疫抑制。胎胰岛免疫原性弱，增殖力强，较成人胰岛更有好的组织通透性，但胎胰岛含量少，数个供体方能满足一个受体需要。同种移植供源有限，学者们积极寻找异种胰岛来源。研究显示，实验鼠、猪胰岛移植给高血糖动物均有可靠降糖作用[4]。由于猪的胰岛素与人的胰岛素仅存在一个氨基酸的差异，因此猪的胰岛成为最有可能用于人的β细胞替代治疗，但存在猪胰岛的抗原性、感染动物传染病和潜在的对异种移植的精神、心理、社会问题等[5]，异种(猪)供体用于临床胰岛移植尚需深入研究。

　　由于胰岛干细胞理论上可以取之不尽且可以进行免疫修饰等处理，干细胞移植成为最有希望解决胰岛来源不足的途径，近年来被国内外学者所关注。胚胎干细胞、成体干细胞和自体胰岛细胞的再生都作为潜在的胰岛细胞来源。但由于诱导分化过程难以控制、细胞过度增殖的潜在可能性等，干细胞移植仍存在一系列的问题有待解决。胚胎干细胞作为最有前景的胰岛细胞替代治疗途径是近年来的研究热点，但诱导的细胞中胰岛细胞比例较低，分泌的激素种类(如胰高血糖素、生长抑素等)也较多，而且存在致肿瘤的危险，在一些国家还存在伦理学争论。既往认为组织内的成体干细胞只能定向分化为该组织的细胞，近年来发现组织内的干细胞也可转分化为其他组织细胞。在胰腺导管、外分泌部分、胰岛和肝脏、脾脏、骨髓等均发现含有可以分化为分泌胰岛素细胞的成体干细胞，虽然不存在伦理学问题，但其转分化过程及调节机制仍不完全清楚，转分化到胰岛样细胞较少。出生后胰岛β细胞在正常生理状态时的凋亡速度和再生速度很慢，在胰岛素抵抗、1型糖尿病、胰腺损伤和妊娠时再生速度加快。目前正在研究寻找可以加快胰岛β细胞再生和减少凋亡的物质，胰高血糖素样肽-1(GLP-1)及其长效类似物exendin-4，可以刺激胰岛素分泌、减少胰岛β细胞凋亡、促进再生，预计会很快应用于临床。其他一些促进胰岛β细胞再生和阻滞凋亡的新药也在研发中，但这些药物是否能够真正促进胰岛β细胞再生、逆转1型糖尿病的病程尚需继续观察[6，7]。

　　3 胰岛分离纯化及移植

　　3.1 胰岛分离

　　胰岛分离的要求是将连接外分泌部和胰岛的结缔组织解离，同时还要保证包括基质在内的内分泌部结构的完整。常用的分离方法有两种：胶原酶消化法和胰岛自动分离系统。此技术始于1960年左右，当时从啮齿类动物体内提取胰岛，其目的是鉴定胰岛β细胞的特征。自从1967年Lacy等从胰腺分离出胰岛并体外培养成功后，胰岛分离纯化技术不断改善，随后，通过胶原酶消化法及Ficoll密度梯度离心法等系列方法，在啮齿类动物体内成功提取了高产量、高纯度的胰岛。1988年，胰岛自动分离系统的发明提高了胰岛收获率，后来 Kenmochi等[8]进一步改进该分离装置，控制消化程度，使胰岛细胞的获取量和纯度进一步提高。目前有研究人员对传统消化胰腺组织提取胰岛细胞的胶原酶V的效率产生了怀疑，Hughes SJ等[9]分别用胶原酶Ⅵ、Ⅴ及Ⅰ型作了比较，结果发现胶原酶Ⅵ比其余两型消化胰腺组织后所得胰岛细胞产量明显要高，不过这个新发现尚需实验进一步证实。

　　3.2 胰岛的纯化和保存

　　胰岛的纯化主要是利用内、外分泌组织因密度不同，而在不同密度的基质中的分布用不同的原理而获得胰岛。目前，胰岛纯化主要采用Ficoll或Dextran密度梯度法。Pittsburgh研究中心用由Eurocollin和Ficoll共同配成的不连续密度作为人胰岛的纯化剂。Kenmochi等[10]报道，用HES-Collins液代替Euro-Ficoll液用于狗的胰岛移植，结果显示，HES-Collins液组胰岛的生存能力和活性均强于Euro-Ficoll组，术后100天内HES-Collins液组的空腹血糖水平在1.0 g/L以内;而Euro-Ficoll组空腹血糖水平则维持在1.0～2.0g/L之间。HES-Collins液可被推荐用于临床胰岛纯化用液。在短期内获取多个供胰为同一受体移植比较困难，因此胰岛组织的贮存技术十分重要。采用PFC/UW液在胰岛分离前2～8h预处理胰腺，可增加产量。

　　3.3 胰岛细胞移植的部位

　　胰岛移植部位要求可重复，安全有效。按移植部位可将胰岛移植分为原位移植和异位移植。原位移植是基于胰岛素经门静脉进入肝脏代谢这一生理基础来确定的，包括门静脉内、肝内、脾内、大网膜及腹腔内等部位的移植。异位移植则指皮下、肌肉内、睾丸内、胸腔内、肾包膜下及脑内等部位的移植。脑内(脑室或蛛网膜下腔)及睾丸组织中缺乏免疫活性细胞，免疫反应微弱，通常认为是免疫特许区，是胰岛移植的重要部位。目前，多采用肝内门静脉注入的方法进行胰岛细胞移植， 门静脉高营养环境，是胰岛移植理想部位。肝脏又是胰岛素的效应器官，利于糖代谢调节。但潜在并发症有出血、门静脉血栓形成、门脉高压等。采用密封袋借助重力作用把胰岛缓慢输入门静脉，可避免门静脉压力急剧升高等并发症[11]。近年来，国内中南大学湘雅三院建立经股动脉插管选择性肝动脉胰岛植入新途径，一定程度上克服了门静脉植入带来的并发症。

　　3.4 胰岛的移植量

　　一般认为，胰岛的移植量，至少要达到全胰的10%～20%，才能维持正常血糖和糖化血红蛋白水平，1名健康成人胰腺中包含大约100万个胰岛，而胰岛移植量>20万个则不依赖胰岛素率明显提高。正常成人胰腺含有30 150万个胰岛当量(IEQ)，临床开展的胰岛细胞移植，大多数病人需要>10 000 IEQs/kg才能达到理想的胰岛素水平，且需要接受2次甚至4次胰岛移植。在胰岛移植过程中，胰岛细胞的数量和胰岛细胞的活性是移植成功的关键所在。对于一个60kg的人平均需要移植857 318个胰岛细胞才能矫正糖尿病，从胰岛细胞的数量上也就是说，需要移植至少2个胰腺的胰岛。加拿大Edmonton Alberta大学医院的最近成功病例显示移植的胰岛量至少为9 000IEQ/kg，大多数病例均需2～3个供胰及2～3次移植，每次移植间隔时间<1个月[12]。

　　4 免疫排斥反应

　　4.1 减轻胰岛免疫原性

　　制备纯净的胰岛可有效地降低免疫原性。低温、冷冻、紫外线照射等，也可降低胰岛的免疫原性。但多伴有胰岛活性的损伤而影响移植效果，所以不作为防止排斥反应的首选措施。

　　4.2 免疫抑制剂

　　皮质类固醇激素应用是器官移植的传统方法，对胰岛素具有抵抗作用，有明显的胰岛毒性，是影响胰岛移植物存活和功能的重要因素之一。2000年Edmonton方案的成功及此后大量改进型的Edmonton免疫抑制方案的成功在于采用无糖皮质激素的联合免疫抑制疗法。典型的Edmonton方案包括达克利珠(抗CD-25单抗)、雷帕霉素(sirolimus)和他克莫司(tacrolimus)，但其中的雷帕霉素和他克莫司已证明对胰岛细胞具有毒性作用，而且二者的毒性有协同作用[13]。Tomer Nir等[14]在特殊的转基因糖尿病小鼠模型中发现残存的胰岛细胞在损伤因素去除后通过细胞增殖而恢复正常形态与功能，但雷帕霉素和他克莫司可以抑制这种胰岛细胞的增殖能力。也在同基因胰岛移植小鼠模型中观察到雷帕霉素可以影响移植胰岛的新生血管形成及胰岛素分泌[15]。尽管如此，目前的免疫抑制方案仍不能完全排除雷帕霉素和他克莫司[16]。对于高PRA(群体抗体反应性)或供者致敏的受体，需要做T细胞清除治疗。目前的免疫抑制方案提高了受者胰岛移植后1年和3年存活率，但大多数受者在移植后5年需要再次注射胰岛素治疗[17]。然而，仍有大约80%的移植物将继续发挥功能和分泌C肽，受者可以维持近似正常的HbA1c，并且很少发生低血糖反应。

　　4.3 免疫隔离

　　免疫隔离胰岛移植物是利用人工装置将移植的胰岛和受体的免疫系统进行隔离。包括微囊包被、半透膜技术。既可以阻止受体的淋巴细胞和抗体对胰岛组织的攻击，又允许胰岛素和营养物质自由出入。但微囊化技术又会妨碍胰岛新生血管形成和营养物质的供应，影响胰岛存活和分泌功能[18]。近来，有应用多层纳米微囊化技术包裹移植胰岛而使移植物获得长时间存活及生理内分泌功能的报道。

　　4.4 诱导免疫耐受

　　通过两种途径可以获得长期免疫无反应性，一是耗损具有破坏移植物潜能的细胞，产生限制性的免疫库，该耗损能产生中枢(胸腺内) 或外周免疫系统耐受;二是训练免疫细胞进入无反应(失能或受体下调诱导) 或者对移植物无害(免疫调节)状态，如竞争细胞因子或黏附分子分泌抑制性细胞因子或修饰APC功能，单克隆抗体清除小鼠CD4阳性细胞后再行胰岛移植，Bcl-2和免疫抑制蛋白CTLA4Ig 联合应用可有效地保护胰岛细胞的功能，抑制免疫反应的启动，有人应用负载异种 MHC 抗原的免疫缺陷型 DC 预处理受体可诱导抗原特异性T细胞无能，以及TH1/TH2细胞因子的低表达， 从而有效地延长异种胰岛细胞存活时间[19]。

　　5 胰岛细胞移植存在的问题与展望

　　近年来胰岛细胞移植治疗糖尿病的研究取得了长足的进展，具有稳定病情、减少外源型胰岛素的用量、防止糖尿病并发症的发生与进展、提高生活质量等多重优点，并有成为糖尿病最终治疗方案的趋势，但它不是万能的，并不适用于各型糖尿病患者，而且应用于临床尚存在很多问题。目前存在的主要问题是胰岛细胞来源不足，投入大，胰岛细胞的分离与纯化技术十分复杂，获得足够数量、纯度和活力的成人胰岛细胞需要极高的技术条件与经验积累，移植后的免疫排斥反应以及随时间而呈现出的移植物功能衰退。

　　虽然胰岛移植仍存在很多困难和争议，道路仍会很艰辛，但随着基因治疗、细胞治疗等的研究，以及细胞工程学的发展， 相信将逐步解决目前困扰移植的难题。随着胰岛分离纯化技术的进一步改善、新的诱导与免疫抑制方案的完善、临床经验的积累技术，相信胰岛移植会发展成为理想的根治糖尿病的方法，使更多的患者受益。

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