地塞米松对小鼠MIN6细胞增殖和凋亡的影响

　　作者：林益川， 王林曦， 王燕萍， 王丽静， 刘小莺， 刘晓红， 刘礼斌 作者单位：福建医科大学附属协和医院内分泌科、福建省内分泌研究所，福州 350001

　　【摘要】目的 探讨地塞米松对小鼠胰岛β细胞株MIN6细胞增殖和凋亡的影响。 方法 实验分对照组和不同浓度地塞米松(50，100，200，400，800 nmol/L)组诱导刺激MIN6细胞1～4 d，MTT法观察地塞米松作用后细胞的存活率;hochest/PI染色荧光显微镜观测细胞凋亡率。 结果 地塞米松作用1～4 d可明显抑制MIN6细胞的生长;>100 nmol/L组的地塞米松处理48 h后，细胞凋亡明显，凋亡率高达(30.44±4.52)%，与对照组比较差别有统计学意义(P<0.01)，800 nmol/L组地塞米松使细胞由凋亡转向坏死。 结论 地塞米松对小鼠MIN6细胞增殖有明显影响，并能够引起MIN6细胞凋亡。

　　【关键词】 地塞米松; 胰岛; 细胞凋亡; 疾病模型; 动物

　　糖皮质激素是体内重要的胰岛素拮抗激素，可以减弱胰岛素介导的糖代谢效应，使胰岛素敏感性降低，甚至发展为糖尿病。这是一个涉及多组织、多水平的复杂过程，包括干扰胰岛素靶器官如骨骼肌及脂肪组织的葡萄糖摄取和利用;调节脂肪细胞因子如脂联素、抵抗素等的分泌，从而间接影响胰岛素的敏感性;抑制胰岛素分泌、触发胰岛细胞凋亡等环节。胰岛细胞凋亡是造成糖尿病的重要原因之一。佟春玲等研究发现，地塞米松处理老鼠3周后胰岛细胞数量减少，功能下降[1];苗明三等也发现地塞米松可造成小鼠糖耐量减低模型[2]。本研究旨在探讨地塞米松是否通过引起胰岛细胞增殖及凋亡从而促进类固醇性糖尿病的发生。

　　1 材料和方法

　　1.1 主要试剂与设备 MIN6小鼠胰岛β细胞株是肉瘤病毒40通过T细胞转染非肥胖糖尿病小鼠(NOD鼠)得到的胰岛细胞瘤株，由上海瑞金医院内分泌肿瘤重点试验室惠赠。DMEM培养基、胎牛血清、0.25%胰酶(美国GIBCO公司)。基础培养基含：高糖DMEM、NaHCO3(2.2 g/L)、青霉素G(0.1 IU/L)、链霉素(0.1 IU/L)和HEPES(2.0 g/L)。地塞米松(美国SIGMA公司);hochest33342、PI(杭州碧云天生物技术研究所)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 MIN6细胞培养与地塞米松处理 26～30代MIN6胰岛β细胞于含15%FBS的DMEM培养液中，在37 ℃、体积分数为0.05的CO2饱和湿度培养箱中培养，80%融合时消化，以每孔密度5×105 mL-1细胞接种于6孔板，培养18 h后进行药物干预。干预分组为：(1)对照组：仅加DMEM培养基;(2)实验组分5组，分别加入不同浓度(50，100，200，400，800 nmol/L)的地塞米松。

　　1.2.2 MTT试验 在96孔培养板中每孔接种100 μL共5×104个细胞，不同浓度的地塞米松作用1，2，3，4 d后，每孔加入5 mg/mL MTT溶液10 μL，37 ℃孵育4 h后小心吸出上清液，每孔加入100 μL DMSO振荡10 min，490 nm波长测定各孔D值，计算细胞存活率。实验重复3次。

　　1.2.3 Hochest/PI双染色荧光显微镜观测细胞凋亡 在6孔培养板中，每孔接种5×105个细胞，不同浓度的地塞米松作用48 h后弃上清，小心用PBS冲洗一遍，每孔加入1 mL PBS，分别加入1 mg/mL Hochest 5 μL和0.1 mg/mL PI 50 μL避光反应10 min，置于荧光显微镜下，在波长为365 nm的紫外光下观察细胞的凋亡情况。记数1 000个细胞，计算细胞的凋亡率。实验重复3次。

　　1.3 统计学处理 数据以x±s表示，采用SPSS 11.5软件。多组间比较用单因素方差分析。

　　2 结果

　　2.1 地塞米松对MIN6细胞存活的影响 不同浓度的地塞米松作用不同时间后，随地塞米松作用剂量和时间的增加，MIN6细胞存活率下降，提示地塞米松可以抑制MIN6细胞的生长(图1)。

　　2.2 地塞米松对MIN6细胞凋亡率的影响 Hochest/PI双染色可以反应细胞凋亡，细胞内被染成红色的是死亡细胞，细胞内有浓聚的蓝色荧光而无红色荧光的是凋亡细胞，细胞内为均匀蓝色荧光的是正常细胞。地塞米松作用48 h后，随着地塞米松浓度的增加，β细胞的凋亡逐渐增加，而800 nmol/L浓度的地塞米松使细胞由凋亡转向坏死(图2～3)。

　　与对照组比较，☆<0.05, ☆☆P<0.01.

　　图1 不同浓度的地塞米松(50,100,200,400,800 nmol/L)作用24～96 h后胰岛细胞的存活率(略)

　　Fig 1 Cell viability of MIN6 cells after exposure of dexamethasone(50,100,200,400,800 nmol/L)for 24～96 h

　　与对照组比较，☆☆:P<0.01.

　　图2 不同浓度的地塞米松(50,100,200,400,800 nmol/L)作用48 h后胰岛细胞凋亡率(略)

　　Fig 2 Cell apoptosis of MIN6 cells after exposure of dexamethasone(50,100,200,400,800 nmol/L)for 48 h

　　A～F：浓度分别为0,50,100,200,400,800 nmol/L.

　　图3 不同浓度的地塞米松(50,100,200,400,800 nmol/L)作用48 h后胰岛细胞Hochest/PI荧光染色(×200)(略)

　　Fig 3 Fluorsecence microscopic analysis after Hochest/PI staining after exposure of dexamethasone(50,100,200,400,800 nmol/L)for 48 h(×200)

　　3 讨论

　　众多研究显示，胰岛素抵抗及胰岛β细胞功能缺陷是2型糖尿病的主要发病机制。β细胞功能缺陷主要包括胰岛细胞分泌障碍及胰岛细胞数量减少，而胰岛细胞数量减少的主要原因是胰岛细胞的凋亡而非新生胰岛细胞的减少。文献报道，高糖、游离脂肪酸、炎症因子、过氧化氢等因素均可以引起胰岛细胞凋亡[34]。糖皮质激素是临床上常用的药物，长期、大量的糖皮质激素会引起血糖升高、胰岛素抵抗，甚至发展为类固醇性糖尿病。国内外也常利用地塞米松建立胰岛素抵抗的动物及细胞模型[56]，其机制可能是糖皮质激素通过影响骨骼肌、脂肪组织、脂肪细胞因子、胰岛β细胞等因素促进胰岛素抵抗的发生，从而进一步引起血糖升高[710]：糖皮质激素可减少肌肉由胰岛素刺激的糖转运, 并且增加糖异生而使肝糖产生增加，减少胰岛素敏感肌肉的糖原合成, 进而影响肌肉的葡萄糖转运。糖皮质激素通过抑制胰岛素信号蛋白(特别是PKB)的表达、GLUT4转位而发挥对脂肪组织糖摄取的抑制作用。也有研究发现地塞米松可以上调3T3L1脂肪细胞中瘦素和内脏脂肪素水平，下调脂联素水平，从而影响糖代谢。Jeong等研究也发现，地塞米松明显降低小鼠胰岛细胞的胰岛素分泌，抑制程度与地塞米松的作用时间、剂量呈正相关[11]。Susanne等也发现，地塞米松不但可以增加胰岛细胞膜钾离子通道的表达，还可以通过显著提高SGK1(血清和糖皮质激素诱导的激酶1)的转录和表达水平，激活细胞膜上的钾离子通道，抑制胰岛素分泌[12]。以上机制均促进类固醇糖尿病的发生。本研究表明，胰岛细胞经过地塞米松预处理后细胞存活率明显下降;地塞米松处理2 d后，胰岛细胞的凋亡率随地塞米松的浓度的升高而升高，结果与MTT结果相符合。提示地塞米松能够引起胰岛细胞的凋亡，其可能是促进类固醇糖尿病形成的原因之一。

　　【参考文献】

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