肥胖小鼠内脏与皮下脂肪Visfatin基因表达

　　作者：林纬， 刘小莺， 周文娟， 林益川， 郑培烝， 刘礼斌 作者单位：福建医科大学 附属协和医院内分泌科;检验科，福州 350001

　　【摘要】目的 观察肥胖对小鼠内脏脂肪和皮下脂肪组织Visfatin基因表达的影响。 方法 高脂饮食喂养刚断乳雄性c57BL/6小鼠8周，诱导营养性肥胖模型。8周后，筛选肥胖小鼠,普通饲料组作为正常对照，实时荧光定量RTPCR方法检测Visfatin的基因表达，分别进行Visfatin基因表达与体质指数、内脏脂肪组织含量及体脂指数相关性的分析。 结果 肥胖组小鼠内脏脂肪组织Visfatin表达明显升高，是对照组的4.76倍(95%可信区间为3.68～6.15,P<0.01);腹部皮下脂肪组织Visfatin表达与对照组比较无明显差异(95%可信区间为1.13±1.51,P>0.05)。 结论 Visfatin在营养性肥胖c57BL/6小鼠内脏脂肪组织中高表达暗示了它可能在肥胖的发生发展中发挥重要的作用，肥胖可能是导致Visfatin基因表达升高的原因之一。

　　【关键词】 肥胖症 细胞因子类 脂肪组织 疾病模型 动物

　　Visfatin是Fukuhara等于2005年发现的一种脂肪因子,与先前在淋巴细胞中发现的一种称为前B细胞克隆增强因子(PreB cell colonyenhancing factor，PBEF)的免疫蛋白结构一致，由于其主要由内脏脂肪组织分泌产生，因此将之命名为Visfatin，即内脏脂泌素[1]。国外研究表明，Visfatin可结合并激活胰岛素受体,模拟胰岛素作用,从而降低血糖;还能够促进脂肪组织的分化、合成及储积[1]。因此，它很可能是与糖尿病和肥胖有关的一个肽类激素。本研究拟通过高脂膳食筛选肥胖的c57BL/6小鼠，通过荧光实时定量RTPCR方法检测肥胖小鼠内脏和腹部皮下脂肪组织Visfatin基因表达的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物及饲料配制 (1)选用健康、雄性、出生21 d左右的c57BL/6小鼠，体质量8.5～10.0 g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供[许可证号：SCXK(沪)20030003]。(2)普通饲料：玉米粉30%，豆饼21.0%，麸皮10.0%，次粉28.0%，鱼粉9.0%，酵母粉1.0%，鱼肝油1%(g/100 g)等。高脂饲料：猪油12.0%，奶粉8.0%，鸡蛋10.0%，花生5.0%，麻油3.0%，以普通饲料补足100 g混成含12%猪油的高脂饲料[2]，食用前2 d配好，低温保存。

　　1.2 动物模型的制备 将39只c57BL/6小鼠适应性喂养1周后，按随机数字法随机分为2组：对照组10只，喂普通饲料;实验组19只，喂高脂饲料。自由饮水，每日早晚2次喂食(昼夜比12∶12),食后不再添加，共饲养8周。每周称体质量1次。8周后，以体质量超过(x对照组体质量+2 s)作为肥胖标准,筛选出营养性肥胖小鼠10只(10/19)作为肥胖组。

　　1.3 标本收集及处理 实验结束后，自由饮水，禁食12 h后以3%戊巴比妥钠，45 mg/kg腹腔注射麻醉。下腔静脉采血，室温静置4 h，3 000 r/min离心10 min，分离血清，-70 ℃保存待测。迅速摘取肾脏周围、肠系膜周围、附睾周围以及腹部皮下(肋弓以下―腹股沟以上，两侧以腋中线为界)的脂肪组织，称取湿质量。所取脂肪组织立即装入无Rnase的Eppendorf管，用液氮速冻，-70 ℃保存备用。

　　1.4 检测方法 体长：从c57BL/6小鼠鼻尖到肛门的长度(cm);体质指数，即Lee's指数=体质量(g)×103/体长(cm)，脂肪垫总质量(g)=肾脏周围脂肪组织+附睾周围脂肪组织;体脂指数=脂肪垫总质量(g)/湿质量(g)。血脂测定：胆固醇(TC)为胆固醇氧化酶法;甘油三酯(TG)为GPO酶法，试剂购自美国Beckman公司;高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)均为酶法检测，试剂购自英国Randox公司，由美国Bckman Cx7全自动生化分析仪检测。

　　1.5 Visfatin mRNA检测 Trizol(Invitrogen)法提取脂肪组织总RNA。依据逆转录试剂盒(A3500,Promaga)说明操作，获得cDNA后，用无RNase的DNase(Promaga)处理，去除可能的基因组DNA污染，再进行实时荧光定量PCR扩增。36B4(NM007475)为内参照基因，其引物(136 bp)：

　　上游：5’AGTGCTCGACATCACAGAGCA3’ 下游：5’GCGCTTGTACCCATTGATGA3’　Visfatin(NM021524)为目的基因，其引物(101bp)：

　　上游：5’TCATTCAAGGAGATGGCGTG3’

　　下游：5’ACCAGAACCGAAGGAGACATTC3’

　　实时荧光定量PCR反应体系：SYBR○R Green PCR Master Mix(Applied Biosystems)10.0 μL，0.2 μmol/L上下游引物各1.0 μL，模板(RT产物1∶2稀释)2.0 μL，总体积为20.0 μL;以NTC(no template control)、NRTC(no reversetranscript control)为阴性对照。反应条件：95 ℃ 10 min→95 ℃ 30 s→60 ℃ 1 min(signal)，60～95 ℃ 20 min(测定熔解曲线)，仪器为德国Roche公司的Light Cycle RealTime PCR仪，结果由仪器配套的软件分析，采用比较阈值法来测定目的基因的相对表达[3]：

　　目的基因的量=2-ΔΔCt

　　ΔΔCt=(Ct目的基因Ct内参基因)实验组(Ct目的基因Ct内参基因)对照组

　　2-ΔΔCt表示的是实验组目的基因的表达相对于对照组的变化倍数，使用这一方法可以直接得到目的基因相对于内参基因的定量。

　　1.6 脂肪组织Visfatin和36B4扩增反应的效率 将对照组所提取的总RNA逆转录成的cDNA，按1∶1、1∶10、1∶100稀释后，同样条件下进行实时定量荧光PCR反应，以cDNA稀释倍数的对数为横坐标，目的基因Ct值与内参基因Ct值的差值为纵坐标，可得一直线，测得斜率为：0.0521(R2=0.9756)，接近0，故可认为内参基因36B4与目的基因Visfatin扩增效率接近一致，可采用比较阈值法(图1)。

　　1.7 统计学处理 上述实验各样品均重复3次。数据用x±s表示，SPSS 11.5软件处理数据，采用单因素方差分析，Pearson相关分析。

　　2 结果

　　2.1 体质量、体质指数、血脂、血糖及内脏脂肪量 与对照组相比，肥胖组小鼠体质量、体脂指数、血总胆固醇、LDLC、HDLC和血糖及内脏脂肪量均升高(P<0.01)，但血TG较对照组降低(P<0.05)(表1，2)。

　　图1 扩增效率曲线示意图(略)

　　Fig 1 Amplification efficiency curv

　　2.2 内脏及腹部皮下脂肪组织实时定量PCR结果 肥胖组小鼠Visfatin基因表达明显升高,是对照组的4.76倍(95%可信区间为3.68～6.15, P<0.01)。腹部皮下脂肪组织实时定量PCR结果：肥胖组小鼠Visfatin基因表达仅为对照组的1.30倍(95%可信区间为1.13±1.51,P>0.05)，无明显升高(表3～4，图2)。

　　2.3 相关性分析 内脏脂肪组织Visfatin基因表达与体质指数(r=0.584,P=0.011)、内脏脂肪组织含量(r=0.676,P=0.002)及体脂指数(r=0.704,P=0.001)均呈正相关，而腹部皮下脂肪组织Visfatin基因表达水平与上述指标均无明显相关性。

　　3 讨论

　　局部脂肪分布,尤其是过多腹部脂肪堆积是冠心病、高血压、高脂血症、糖尿病的重要危险因素，其中腹腔内脏脂肪组织与胰岛素抵抗关系最为密切[46]，其次为腹部皮下脂肪组织。本研究中所建立的营养性肥胖c57BL/6小鼠模型，其腹腔内脏脂肪组织湿质量、腹腔内脏脂肪组织含量、体脂指数及内脏脂肪组织量/腹部皮下脂肪组织量均较对照组显著增加(P<0.01)，此特征更符合人类2型糖尿病和代谢综合征相关的腹型肥胖的特点，适合于研究肥胖与2型糖尿病及代谢综合征之间的相关性。

　　表1 对照组与肥胖组c57BL/6小鼠血清指标比较(略)

　　Tab 1 Blood serum index

　　CHOL：胆固醇;TG：甘油三酯;LDL：低密度脂蛋白;HDL：高密度脂蛋白. 与对照组组比较，☆☆：P<0.01.

　　表2 对照组与肥胖组c57BL/6小鼠脂肪组织相关指标比较(略)

　　Tab 2 The index of adipose tissue

　　VFAT：内脏脂肪组织总量;SFFAT：皮下脂肪组织总量. 与对照组比较，☆☆：P<0.01.

　　表3 内脏脂肪组织实时定量测定结果(略)

　　Tab 3 The realtime quantitative results of abdominal visceral adipose tissue

　　与对照组比较，☆☆：P<0.01.

　　表4 皮下脂肪组织实时定量测定结果(略)

　　Tab 4 The realtime quantitative results of abdominal subcutaneous adipose tissue

　　A、C为扩增曲线，B、D为熔解曲线. A、B为内脏脂肪组织;C、D为皮下脂肪组织.

　　图2 内脏与皮下脂肪36B4与Visfatin基因扩增曲线与熔解曲线(略)

　　Fig 2 Amplified curve and melting curve of 36B4 and Visfatin

　　本研究结果显示，营养性肥胖组c57BL/6小鼠内脏脂肪组织Visfatin基因表达显著增高，是对照组的4.76倍(P<0.01)，而皮下脂肪组织却无明显改变，暗示Visfatin可能在肥胖的发生发展中发挥重要的作用，肥胖可能是导致Visfatin基因表达升高的原因之一。这与Fukuhara等的研究结果相一致[1]。然而，Visfatin的许多特征仍表明该因子对于了解内脏脂肪和皮下脂肪不同生物学特性以及它们对于代谢综合征的不同影响具有重要意义。首先，Visfatin主要由内脏脂肪组织分泌，其水平与内脏脂肪量相关而与皮下脂肪无关。其次，高脂饮食诱导的肥胖能够增加内脏脂肪组织Visfatin基因表达的事实表明它在饮食或者肥胖诱导的胰岛素抵抗中扮演着重要的角色。可见Visfatin是一种主要由腹部脂肪分泌的，沟通内脏脂肪过度膨胀和胰岛素抵抗的独特的脂肪因子。虽然，Fukuhara等清晰地阐明Visfatin的内分泌效应，然而，尚不能排除Visfatin也可能具有对内脏脂肪组织的旁分泌效应，通过促进脂肪细胞的分化，从而促进脂肪合成、储积[1]。事实上，在前脂肪细胞系过表达的Visfatin能够促进前脂肪细胞分化为成熟的脂肪细胞，并且通过激活糖的转运和脂肪的合成，促进脂肪的累积。第三、Visfatin对脂肪组织的作用通过其定位于细胞内(胞质和胞核)而进一步证实，暗示了其在细胞周期调节中的作用[7]，进一步支持了Visfatin对脂肪组织有直接效应。因此，Visfatin可能具有双重的作用：一方面，通过自分泌或旁分泌效应作用于内脏脂肪组织，促进脂肪细胞的分化和脂肪组织的储积;另一方面，通过内分泌效应调节外周器官的胰岛素敏感性。

　　本研究中相关性分析显示，内脏脂肪组织Visfatin基因表达的水平与体质指数、内脏脂肪组织含量及体脂指数均呈正相关，而腹部皮下脂肪组织Visfatin基因表达水平与上述指标均无明显相关性。Chen等也在试验中发现Visfatin与腰臀比呈正相关,同时腰臀比是血浆Visfatin水平的独立相关因素,这也进一步提示Visfatin与内脏脂肪之间存在紧密联系,即内脏脂肪的含量越多,Visfatin基因表达水平越高[8]。Berndt等的研究也发现，血浆Visfatin浓度和内脏脂肪Visfatin mRNA表达水平与体质量指数、体内脂肪含量明显相关，亦提示该因子与肥胖相关[9]。

　　综上，Visfatin是新近才由内脏脂肪分离出来的一种生物活性肽,能够促进脂肪形成，并具有胰岛素模拟作用。本研究发现，Visfatin在营养性肥胖c57BL/6小鼠内脏脂肪组织中高表达，暗示了它可能在肥胖的发生发展中发挥重要的作用，高脂饮食可能是导致Visfatin基因表达升高的原因之一，与内脏脂肪之间存在紧密联系。然而，它与代谢综合征的关系或者它在代谢综合征中的生理作用尚不清楚。Visfatin可能是促进内脏脂肪储积的参与机制，是防止内脏脂肪的过度膨胀损害胰岛素敏感性的反馈机制，或者仅仅是一个内脏脂肪量增加和心血管危险因素增加的一种标记，将有待于深入研究。

　　【参考文献】

　　[1] Fukuhara A,Matsuda M,Nishizawa M, et al. Visfatin: a protein secreted by visceral fat that mimics the effects of insulin[J]. Science, 2005,307(5708):426430.

　　[2] 钱伯初. 肥胖动物模型的制备原理和方法[J]. 中国药理学通报, 1993,9(1):7576.

　　[3] Livak K J,Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using realtime quantitative PCR and the 2(Delta Delta C(T) ) method[J]. Methods, 2001,25(4):402408.

　　[4] Feinleib M. Epidemiology of obesity in relation to health hazards[J]. Ann Intern Med, 1985, 103(6):10191024.

　　[5] Weisberg S P,McCann D,Desai M, et al. Obesity is associated with macrophage accumulation in adipose[J]. Clin Invest, 2003,112(12):17961808.

　　[6] Freedland E S. Role of a critical visceral adipose tissue threshold (CVATT) in metabolic syndrome: implications for controlling dietary carbohydrates: a review[J]. Nutrition & Metabolism, 2004,1(1):12.

　　[7] Kitani T,Okuno S,Fujisawa H. Growth phasedependent changes in the subcellular localization of preBcell colonyenhancing factor[J]. FEBS Lett, 2003,544(13):7478.

　　[8] Chen M P,Chung F M,Chang D M, et al. Elevated plasma level of visfatin/ PreB cell colony enhancing factor in patients with type 2 diabetes mellitus[J]. J Clin Endocrinol Metab, 2005,91(1):295299.

　　[9] Berndt J,Kloting N,Kralishch S, et al. Plasma visfatin concentrations and fatdepotspecific mRNA expression in humans[J]. Diabetes, 2005,54(10):29112916.