地塞米松诱导3T3L1脂肪细胞胰岛素抵抗模型的建立

　　作者：王丽静 作者单位：福建医科大学 附属协和医院内分泌科，福州350001

　　【摘要】 目的应用地塞米松诱导3T3L1脂肪细胞，探讨建立方便可靠的胰岛素抵抗(IR)细胞模型的方法。方法3T3L1前脂肪细胞经1甲基3异丁基黄嘌呤、地塞米松、胰岛素诱导分化成3T3L1脂肪细胞,将其与10 nmol/L和100 nmol/L、1 μmol/L地塞米松共孵育，100 nmol/L胰岛素作用30 min刺激脂肪细胞糖转运。以葡萄糖氧化酶法测定培养液中残余的葡萄糖含量，观察地塞米松对脂肪细胞糖摄取的影响，鉴定IR模型。结果地塞米松抑制胰岛素诱导前后的脂肪细胞糖转运，抑制作用呈剂量依赖性，其中1 μmol/L地塞米松的抑制率分别为80%及75%(P<0.05)。结论地塞米松可诱导3T3L1脂肪细胞产生IR，这种细胞模型简便、可靠。

　　【关键词】 地塞米松 胰岛素抗药性 胰岛素 3T3L1细胞

　　胰岛素抵抗(IR)是2型糖尿病、肥胖、动脉粥样硬化等疾病的共同发病基础，研究IR发生机制成为当今的重要课题。糖皮质激素是重要的胰岛素拮抗激素，临床上的过量应用会导致糖耐量异常甚至糖尿病的发生，动物试验中常用于建立糖尿病模型[12]。笔者以3T3L1脂肪细胞为研究对象，将糖皮质激素的长效类似物地塞米松与3T3L1脂肪细胞共孵育，观察处理前后3T3L1脂肪细胞对胰岛素短时诱导的葡萄糖摄取量的变化，探讨利用地塞米松建立3T3L1脂肪细胞IR模型的可行性。

　　1材料与方法

　　1.1材料

　　1.1.1细胞3T3L1前脂肪细胞株由上海内分泌代谢病临床医学中心惠赠。

　　1.1.2试剂DMEM培养基、胰蛋白酶(美国Gibco公司)。胎牛血清(美国PAA公司)。胰岛素(丹麦诺和诺德公司)。地塞米松(D4902)、1甲基3异丁基黄嘌呤(1methyl3isobuthylxanthine,I5879,美国Sigma公司)。葡萄糖检测试剂盒(瑞士Roche公司)。

　　1.1.3仪器二氧化碳培养箱(MCO15AC，日本Sanyo公司)。生化检测仪(CX7，美国Beckman公司)。

　　1.2方法

　　1.2.13T3L1前脂肪细胞的培养和诱导分化3T3L1前脂肪细胞以含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、0.1 mg/mL链霉素的DMEM培养液，在37 ℃、体积分数为0.07的CO2的条件下培养，隔天换液1次。细胞融合达80%～90%时，以0.25%胰蛋白酶消化、传代接种至24孔培养板上。细胞融合后，加含0.5 mmol/L 1甲基3异丁基黄嘌呤、1 μmol/L地塞米松和10 μg/mL胰岛素的DMEM培养液培养48 h[3];再以含10 μg/mL胰岛素的DMEM培养液培养48 h，随后以DMEM培养液继续培养6 d，诱导分化10 d左右的3T3L1细胞90%呈脂肪细胞表型，细胞内可见明显脂滴。

　　1.2.2油红O染色法鉴定脂肪细胞以10%多聚甲醛固定细胞10 min,PBS洗去后晾干。加油红O染液10 min后弃去，以异丙醇洗细胞2次，用苏木精染细胞核2 min。水洗5～10 min，倒置显微镜下观察结果，拍摄照片。

　　1.2.3分组将3T3L1脂肪细胞分为基础(非诱导)组和胰岛素诱导组(诱导组)，每组再分为对照组、10 nmol/L，100 nmol/L和1 μmol/L地塞米松组。细胞同步化12 h，每孔加入含地塞米松的培养液，终浓度分别为10 nmol/L、100 nmol/L、1 μmol/L;对照组加入等体积培养液。温育48 h后诱导组中4个实验组均加入100 nmol/L胰岛素继续温育30 min。

　　1.2.4测定3T3L1脂肪细胞糖转运取细胞上清液。用葡萄糖氧化酶法测定上清液的葡萄糖含量，以未接种细胞空白复孔的糖含量均值相减，得出各孔细胞的葡萄糖消耗量。

　　1.3统计学处理数据以x±s表示,用SPSS 11.0软件进行统计学处理。各组间的比较采用单因素方差分析，对照组与不同浓度地塞米松组之间的比较采用Duncan法。将药物浓度值进行对数转换，采用直线回归分析药物浓度和抑制作用的关系。2结果A：3T3L1前脂肪细胞;B：3T3L1脂肪细胞;C：鉴定3T3L1脂肪细胞(油红O染色).

　　图13T3L1前脂肪细胞的诱导分化及鉴定(×200)

　　Fig 1Identification of 3T3L1 adipocytes with oil red staining2.13T3L1前脂肪细胞的诱导分化及鉴定经1甲基3异丁基黄嘌呤、地塞米松、胰岛素诱导分化10 d后，细胞变圆、变亮，细胞质中大量圆形脂肪滴聚集，称为3T3L1脂肪细胞。以油红O染色鉴定3T3L1脂肪细胞，可见细胞质内脂肪滴被染成红色，细胞核呈蓝色(图1)。

　　2.2地塞米松对3T3L1脂肪细胞糖转运的影响

　　2.2.1非诱导组100 nmol/L、1 μmol/L地塞米松处理48 h后，葡萄糖转运量较之对照组均有明显下降(P<0.05)，提示地塞米松抑制3T3L1脂肪细胞的基础状态糖转运(表1)，这种抑制作用呈剂量依表1地塞米松对3T3L1脂肪细胞糖转运的影响赖性，其中1 μmol/L地塞米松的抑制率达80%(表2)。

　　2.2.2诱导组对照组中，100 nmol/L胰岛素温育30 min后可明显增加脂肪细胞的葡萄糖转运量(P<0.05)，说明脂肪细胞对胰岛素敏感，胰岛素短时刺激可促进3T3L1脂肪细胞糖转运。100 nmol/L、1 μmol/L地塞米松处理48 h后，胰岛素的诱导作用减弱，葡萄糖转运量较之对照组均有明显下降(P<0.05)，提示在3T3L1脂肪细胞中，地塞米松降低了脂肪细胞对胰岛素的敏感性，抑制胰岛素依赖葡萄糖转运，这种抑制作用呈剂量依赖性，1 μmol/L地塞米松可使胰岛素诱导的糖转运降低75%(表2)。表 2地塞米松的浓度和对糖转运抑制作用的关系

　　3讨论

　　胰岛素具有广泛的生物效应，包括调节糖、脂肪、蛋白质代谢，促进细胞增殖、调控基因转录等，最主要的是促进葡萄糖代谢。IR是指体内胰岛素执行其正常生物作用的效应不足。在一般情况下，IR是指一定浓度的胰岛素不能有效地促进外周靶器官(肌肉、肝脏及脂肪组织)对葡萄糖的摄取和利用，糖耐量降低最终导致糖尿病。1995年Stern提出“共同土壤”学说，认为IR是滋生糖尿病、高血压、冠心病等多种代谢相关疾病的共同土壤[4]。

　　建立IR细胞模型可以在细胞及分子水平深入研究IR的发生机制、体外筛选防治IR的药物，解决了无法广泛开展人体及动物试验的局限性。国内外已利用高游离脂肪酸、高胰岛素、IL6等方法建立多种IR细胞株，并用于相关课题的基础研究[56]。糖皮质激素是引起IR的重要激素，和IR之间存在复杂的相互关系。IR的病例中会出现不同程度的糖皮质激素活性增高，长期、大量的糖皮质激素会引起IR，动物试验中也常利用大剂量糖皮质激素建立糖尿病动物模型。目前认为地塞米松诱导IR的机制包括干扰胰岛素信号途径，抑制骨骼肌及脂肪组织的糖摄取和利用;促进肝脏糖异生;抑制胰岛素分泌、触发胰岛细胞凋亡;通过调节脂肪细胞因子的分泌间接影响胰岛素的敏感性等环节[1，78]。确切机制仍未明确，建立地塞米松诱导IR模型，有助于深入探讨和研究其分子机制。

　　近年随着肥胖发病率的上升以及新的脂肪细胞因子的不断发现，脂肪组织在IR中的作用日益被人们所重视[9]。3T3L1前脂肪细胞是源于Swiss albino小鼠胚胎的成纤维细胞，根据诱导成脂肪细胞的方案[3]，可避免原代脂肪细胞取材、纯度不一、生存能力差及实验结果不稳定的缺点，已广泛应用于体外IR模型中葡萄糖转运及脂肪细胞分泌功能的研究。笔者以3T3L1脂肪细胞为研究对象，将地塞米松与3T3L1脂肪细胞共孵育诱导IR，模拟体内胰岛素短时作用刺激糖转运。利用葡萄糖氧化酶法比较胰岛素诱导前后葡萄糖消耗量的变化，鉴定模型。该方法与同位素标记的糖摄取实验(3H、12C标记葡萄糖掺合试验等)相比，虽然在灵敏性上略有欠缺，但操作简单、经济方便，避免了同位素实验需要特定场地仪器、注意防范射线侵害、特殊产物处理、价格昂贵等缺点。实验结果显示，地塞米松不但降低了3T3L1脂肪细胞基础状态的糖转运，而且抑制了胰岛素促进糖转运的活性，诱导IR的形成。这种抑制作用呈剂量依赖性(P<0.05)， 其中1 μmol/L地塞米松对胰岛素诱导前后的抑制率分别为80%及75%。这种地塞米松诱导脂肪细胞抵抗模型的方法简便快捷、重复性好，为此类课题研究提供一个较好的手段。

　　【参考文献】

　　[1]Hideyuki S,Takehide O,Motonobu A,et al. Dexamethasoneinduced insulin resistance in 3T3L1 adipocytes is due to inhibition of glucose transport rather than insulin signal transduction[J]. Diabetes, 2000,49(10):17001708.

　　[2]张芳林,张闿珍. 超生理剂量地塞米松对大鼠胰岛细胞的影响[J]. 中华内分泌代谢杂志, 2000,16(5):323324.

　　[3]Brent C,Daniel M. Insulin receptor synthesis and turnover in differentiating 3T3L1 preadipocytes[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1980,77(1):285289.

　　[4]Stern M P. Diabetes and cardiovascular disease,the “common soil” hypothesis[J]. Diabetes, 1995,44(4):369374.

　　[5]Mengwei Z,Adriana Z,Xiuyun H. AMPactivated protein kinase is required for the lipidlowering effect of metformin in insulinresistant human HepG2 cells[J]. J Biolog Chem, 2004,279(46): 4789847905.

　　[6]Sandeep S,German P,Nicholas F B,et al. Fatty acidinduced insulin resistance in L6 myotubes is prevented by inhibition of activation and nuclear localization of nuclear factor[J]. J Biolog Chem, 2004,279(40):4129441301.

　　[7]Felicia R,Diana A,Susanne B,et al. Dexamethasone induces cell death in insulinsecreting cells, an effect reversed by exendin4[J]. Diabetes, 2006,55(5):13801390.

　　[8]Halleux C,Takahashi M,Delporte M,et al. Secretion of adiponectin and regulation of apM1 gene expression in human visceral adipose tissue[J]. Biochem Biophy Res Commun, 2001,288(5):11021107.

　　[9]刘礼斌,刘小莺,王燕萍. 肥胖和2型糖尿病血浆脂联素水平及与体质量指数的相关性[J]. 福建医科大学学报, 2004，38(4):5960.