线粒体DNA3316、3394等4个突变位点与2型糖尿病的关系研究

　　作者：熊燏 作者单位：武汉大学医学院05级在职硕士生，湖北 武汉 430071

　　【摘要】 目的：探讨DNA tRNA Leu (UUR)基因及ND1基因3316 G/A、3394 T/C等4个突变位点与2型糖尿病的关系。方法：对 236例海南地区2型糖尿病患者和252例健康对照者进行空腹血糖测定并采用聚合酶链式反应—限制性核酸内切酶片段长度多态性(PCRRFLP)的分析方法进行mtDNA的3243、3316、3394、和3593共4个位点进行突变筛选，并采用DNA测序方法确证。结果：实验组空腹血糖(9.37±3.01) mmol/L与健康对照组(4.96±0.76) mmol/L差异有统计学意义(P<0.05);实验组检出3316(G→A)突变8例，3394(T→C)突变3例;健康对照组未发现上述突变;突变检测结果与测序一致。两组间3316(G→A)突变率差异有统计学意义(P<0.05)。结论：线粒体DNA tRNA Leu (UUR)基因及ND1基因3316、3394位点的基因突变，尤其是3316位点(G→A)突变可能与某些核基因或环境因素协同促进了2型糖尿病的发生。

　　【关键词】 DNA 线粒体 突变 糠尿病 非胰岛素依赖型 聚合酶链反应

　　Study on relationship between point mutations of mitochondrial gene and type 2 diabetes mellitus

　　XIONG Yu1,2, QIAN Shiyun2

　　(1.Medical School of Wuhan University, Wuhan 430071, China; 2.Department of Clinical Laboratory, Hainan Medical College, Haikou 570102, China)

　　[ABSTRACT] Objective: To explore the relationship between various mitochondrial DNA tRNA Leu (UUR)gene / ND1 gene mutations and type 2 diabetes. Methods: Casecontrol study was designed. Fasting blood glucose levels in 236 patients with type 2 diabetes mellitus (study group) and 252 healthy subjects (control group)were determined respectively. Polymerase chain reaction restriction fragment length polymorphism (PCRRFLP) analysis was used first to screen point mutations of mtDNA at positions of 3243, 3316, 3394, and 3593; DNA sequencing was adopted to confirm the mutations followed; all the mutations were analyzed by PRIMER and NCBI BLAST softwares at last. Results : The levels of fasting blood glucose in study group and control group were (9.37±3.01) and (4.96±0.76) respectively, compared with them, there was significant difference (P<0.05). In study group, there were 8 carriers ( 3.4%) of 3316 G→A (Ala→Thr) mutation, 3 carriers (1.3%) of 3394 T→C (Tyr→His) mutation with type 2 diabetes mellitus. In control group, no mutation was found. There was significant difference between the two groups for 3316 G→A mutation frequencies (P<0.05). Conclusion: Mutations at np 3316, in DNA ND1 gene, and at np3394 may play a certain role with the coactions of some nuclear DNA or /and environmental factors for the incidence of type 2 diabetes mellitus.

　　[KEY WORDS] DNA, mitochondria; Mutation; Diabetes mellitus, insulin nonindependent; Polymerase Chain Reaction (PCR)

　　糖尿病是由遗传和环境等多因素交互作用所造成的，线粒体DNA是双链环状分子，诸多研究表明线粒体DNA变异在胰岛素抵抗和胰腺β细胞丧失功能中扮演了非常重要的角色[1,2]。本研究采用PCRRFLP和DNA测序方法，对位于线粒体tRNA Leu (UUR)基因的3243(A→G)突变及位于ND1基因3316(G→A)、3394(T→C)、3593(T→C)共4个突变位点同时进行筛查，试图探讨其与2型糖尿病发生的关联性，

　　1 材料和方法

　　1.1 对象

　　病例组按2001年WHO 2型糖尿病诊断标准确诊的患者236例。患者中男性157例，女性79例，年龄(54.41±11.34)岁，均无亲缘关系。对照组为健康体检者252名，其中男性155例，女性97例，年龄(57.26±13.11)岁，排除糖代谢紊乱的相关疾病，临床检查和实验室检查结果未见异常，两组间年龄(P>0.05)，年龄构成比(P>0.05)和性别构成比(P>0.05)均匹配，以上研究对象均为汉族，且在海南地区居住达10年以上。

　　1.2 主要试剂与仪器

　　葡萄糖测定试剂盒(上海申能公司)、TaqDNA聚合酶(美国Promega公司)、限制性核酸内切酶HaeⅢ(New Labs, England)、Qiaquick PCR Purification Kit(美国Qiagen公司)、WVBP330/G凝胶成像系统(江苏捷达)。

　　1.3 方法

　　1.3.1 临床生化指标检测 采取空腹12 h外周血，EDTA抗凝，用酶法测定葡萄糖，所有待测标本均在雅培全自动生化分析仪上进行检测。

　　1.3.2 突变筛选 采用改良NaI法提取外周血样本DNA作为模板。根据Genbank J01415(剑桥序列)，参照引物设计原则，采用primer premier 5.0软件设计设计引物1对 ( P1 5′AGCGCCTTCCCCCGTAAATGA3′ ;P2 3′CTTCAGTGGGATCGGTAGTAAGA5′)， 产物长度为596 bp(nt31593755)，包括整个的tRNALeu(UUR)(nt32303304)和大部分的ND1(nt33074263)区域，由上海生工合成。

　　25 μL扩增体系中包含100 ng模板DNA、P1和P2各10 μmol、dNTPs 200 μmol/L、MgCl2 1.5 mmol/L、10×Buffer 2.5 μL、TaqDNA聚合酶1 U。扩增条件为95 ℃预变性5 min;35个循环94 ℃变性45 s、58 ℃退火35 s、72 ℃延伸45 s;最后72 ℃延伸7 min。扩增产物涵盖了4个突变位点(np 3243、3316、3394、3593)，经含GoldviewTMDNA染料的1.5%的琼脂糖凝胶电泳鉴定。

　　20 μL酶切体系包含PCR产物5 μL，HaeⅢ内切酶5 U，10×Buffer 2 μL ;37 ℃水浴3 h。酶切产物经8%聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染显影鉴定。

　　将酶切后电泳条带异于野生型的DNA样品重新进行PCR扩增并双向测序，测序结果经PRIMER软件和NCBI BLAST软件比对分析，确定突变位点及其编码氨基酸的变化。

　　1.4 统计学处理

　　采用SPSS11.0统计软件的Fisher精确概率法，χ2检验和t检验进行分析。

　　2 结果

　　2.1 病例组和对照组的空腹血糖结果

　　病例组空腹血糖(FPG)(9.37±3.01) mmol/L与对照组(4.96±0.76) mmol/L差异有统计学意义(P<0.05)。

　　2.2 PCRRFLP分析结果

　　核酸内切酶HaeⅢ识别序列为GG^CC，野生型无突变者在3316、3413、3428和3608处存在酶切位点，产物为180、159、147、97和15 bp 5个片段。若np3243、3316、3394、3593位点发生突变，可导致酶切位点消失或出现新的酶切位点，产物片段的大小和数量则发生相应的变化。对照组未检出以上突变，病例组检测结果见表1。表1 实验组突变筛选结果

　　2.3 测序结果

　　测序结果见图1 。共检出2个突变位点，检出各突变位点测序结果与PCRRFLP图谱一致。 图2 tRNA Leu(UUR)和ND1基因2个SNPs测序图谱

　　3 讨论

　　线粒体的主要功能为通过氧化磷酸化为人体细胞提供ATP，胰岛β细胞90%以上能量来自于线粒体。线粒体基因突变致糖尿病的机制可能系胰岛β细胞葡萄糖氧化磷酸化障碍，ATP产生不足，致胰岛素分泌障碍。

　　研究发现，病例组3316(G→A)突变率为3.4%，病例组与对照组两组之间差异有统计学意义;而3394(T→C)突变率为1.3%，两组差异无统计学意义。np3316突变和np3394突变均位于ND1基因保守区，np3316突变使Ala→Thr，而np3394突变使Tyr→His，从而使NADH脱氢酶(复合体Ⅰ)亚单位1的二级结构发生了改变，影响呼吸链复合体Ⅰ酶活性，导致线粒体氧化磷酸化功能受损，降低胰腺β细胞分泌胰岛素的能力，促进了糖尿病的发生[1,2]。

　　tRNA Leu (UUR)基因上nt3243突变是报道中突变频率较高的致病性突变之一，本实验采用HaeⅢ酶切，在两组实验对象中均未检出该位点突变，其原因可能有：①地域和人群差异，不同国家和地区该位点突变率差异较大[1～2,3～5]，文献[1，3～5]该位点突变率均为0%。有文献[3]指出该位点突变可能是一生理性突变，只和年龄以及病程长短有关，而不能肯定其与糖尿病的发生的相关性;②肌肉和组织中(主要是肾脏、心肌细胞、肝脏等)该位点的突变率较高，本实验采用外周血DNA，突变率较低。

　　【参考文献】

　　1 Liu SM, Zhou X, Zheng F, et al. Novel mutations found in mitochondrial diabetes in Chinese Han Population[J]. Diabetes Res Clin Pract,2007,76:425435.

　　2 Momiyama Y, Furutani M, Suzuki Y, et al. A mitochondrial DNA variant associated with left ventricular hypertrophy in diabetes[J]. Biochem Biophys Res Common,2003,213(3):858864

　　3 Nomiyama T, Tanaka Y, Hattori N, et al. Accumulation of somatic mutation in mitochondrial DNA extracted from peripheral blood cells in diabetic patients[J]. Diabetologia, 2002,45(11):15771583.

　　4 唐璟, 李家林, 田兴亚,等.线粒体DNA 3243、3316点突变与2型糖尿病[J].中华医学遗传学杂志,2005,22(2):198200.

　　5 钱杰, 张丽容.线粒体DNA的ND1基因点突变与2型糖尿病的关系[J].中华内分泌代谢杂志, 2003,19(1):4647.