中国早发2型糖尿病家系MODY 1-5基因测定

　　作者：严晋华， 沈云峰， 余秋琼， 梁 华， 蔡梦茵， 翁建平 作者单位：(中山大学附属第三医院内分泌科， 广东 广州 510630)

　　【摘要】 【目的】 通过对早发2型糖尿病家系先证者进行直接测序，寻找中国人群中可能存在的青少年的成人发病型糖尿病(MODY) 1-5基因突变。【方法】 对19个早发2型糖尿病家系的先证者进行MODY 1-5基因扩增和DNA直接测序。【结果】 19个先证者未发现MODY基因突变，但发现MODY 1-5基因分别存在6、5、15、1、1种多态性。【结论】 MODY相关基因突变具有种族异质性，MODY 1-5基因突变不是该19个早发糖尿病家系的致病因素。

　　【关键词】 早发2型糖尿病; 基因突变; 青少年的成人发病型糖尿病

　　Screening for Mutations of MODY 1-5 Genes in Chinese Families

　　with Early-onset Type 2 Diabetes

　　YAN Jin-hua， SHEN Yun-feng， YU Qiu-qiong， LIANG Hua， CAI Meng-yin， WENG Jian-ping

　　(Department of Endocrinology， The Third Affiliated Hospital， SUN Yat-sen University， Guangzhou 510630， China)

　　Abstract： 【Objective】 The aim of our study was to seek the mutations in MODY1～5 genes in Chinese population by direct sequencing in probands from families with early-onset type 2 diabetes. 【Methods】 Variants screening in MODY 1-5 genes were performed by PCR and direct sequencing in 19 probands from early-onset type 2 diabetes families. 【Results】 We found no mutation but many polymorphisms. There were 6， 5， 15， 1， and 1 variants in MODY 1-5 genes respectively. 【Conclusion】 Our negative results in MODY genes suggest the genetic heterogeneity of different populations. Mutations in MODY 1-5 genes might not be the cause of diabetes in those 19 families.

　　Key words： early-onset type 2 diabetes; gene mutation; maturity-onset diabetes of the young

　　[J SUN Yat-sen Univ(Med Sci)，2009，30(4)：437-440;inside of back cover]

　　青少年的成人发病型糖尿病(maturity-onset diabetes of the young， MODY)是一组具有高度遗传和临床表型异质性的糖尿病亚型，MODY由单基因遗传缺陷引起的，迄今为止，已发现6种MODY相关基因[1]：MODY1/肝细胞核因子-4α(hepatic nuclear factor-4α，HNF-4α)， MODY2/葡萄糖激酶(glucokinase， GCK)，MODY3/肝细胞核因子1α(HNF-1α)，MODY4/胰岛素启动子因子1(insulin promoter factor 1， IPF1)，MODY5/肝细胞核因子1β(HNF-1β)，MODY6/神经源性分化因子1(neuroD1/BETA2)。通过基因学分析确定突变是目前研究MODY的主要手段，国外[2]和我国香港学者[3]对有家族史的早发2型糖尿病家系( < 40岁)进行基因筛查，发现有相当比例的家系存在MODY基因的突变。本试验拟通过对早发2型糖尿病家系先证者进行MODY 1-5基因直接测序，寻找中国人中可能存在的MODY基因突变。

　　1 材料和方法

　　1.1 对 象

　　从广东省糖尿病中心患者资料库中(2000年 至2005年收集)选取同时符合以下两个条件的19个早发2型糖尿病家系：① 3代糖尿病家族史或2代糖尿病家族史且同一辈中有3个或以上糖尿病患者(祖辈代已逝但有明确糖尿病史者包括在内);② 家族中有1个或以上患者在35岁以前发病。糖尿病的诊断按照世界卫生组织(WHO)1999年糖尿病的诊断标准。19个家系中，15个家系为3代糖尿病家族史，4个家系为两代糖尿病家族史且同一辈中有3个或以上糖尿病患者。先证者发病年龄是(35 ± 12)岁(范围15 ～ 53岁)，BMI为(24.7 ± 3.8)kg/m2(范围17.4 ～ 32.2 kg/m2)，空腹C肽为(0.45 ± 0.23)pmol/mL(0.16 ～ 0.87 pmol/mL)，GAD均阴性，无酮症倾向。

　　1.2 研究方法

　　1.2.1 外周血DNA提取 取全血3 mL，以酚氯仿法抽提白细胞中DNA。

　　1.2.2 线粒体基因检测 线粒体糖尿病亦是患病率较高的单基因突变糖尿病，在进行MODY筛查前，需要先对其进行排除。我们采用聚合酶链-限制性片段长度多态(PCR-RFLP)法，首先进行线粒体基因tRNALEU(UUR)3243A→G位点的检测，19个先证者中未发现该位点的突变。

　　1.2.3 MODY 1-5基因扩增 以19个家系先证者外周血DNA为模板，采用聚合酶链反应(PCR)，扩增MODY 1-5基因(包括启动子区、增强子区、外显子及其相邻拼接区)。MODY4基因的2个外显子扩增使用TAKARA公司的LA TaqTM DNA聚合酶，其他扩增片段均选用Ampli Taq DNA聚合酶。热循环计划为预变性94 ℃ 4 min;变性94 ℃ 30 s，54 ～ 64 ℃退火30 s， 延伸72 ℃ 40 s，共30个循环;最后终末延伸72 ℃ 10 min。扩增产物用2.5%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色后紫外线下观察。

　　1.2.4 DNA序列测定 荧光标记纯化后的PCR产物并在ABI 3100-Avant型遗传分析仪上样测序(500 bp以上或富含GC的片段用377遗传分析仪)。测序结果与Pubmed Genebank上公布的标准序列进行比较分析，从而判定变异的位点及编码氨基酸序列的变化。

　　2 结 果

　　19 个家系先证者未发现MODY基因突变，但发现多种多态性(表1)，分别是MODY1基因6种，MODY2基因5种，MODY3基因15种，MODY4基因1种，MODY5基因1种变异，均为国内外报道过的多态性。

　　我们对本研究的19个家系先证者的临床表型进行进一步分析，并将其与文献中提及的MODY-X进行比较，发现这些家系有相似之处，如发病年龄较晚，BMI相近，血脂水平相当(表2)。

　　在19个家系中，有1个家系(CAO，家系图1)的显性糖尿病的发生率极高，尤其是第2代几乎全受累。该家系初诊时共检查了3代共20人，第2代10人中有8人确诊为糖尿病，1人为糖耐量异常(Ⅱ8)，1人拒绝检查(Ⅱ9)，第3代9人中有3人患糖尿病，1人为糖耐量异常。1年后随访，第2代的Ⅱ8和Ⅱ9均进展为糖尿病，这个高度外显的家系的诊断年龄为(47.8 ± 14.0)岁。

　　3 讨 论

　　3.1 MODY分布的种族异质性

　　MODY广泛分布于欧洲、拉丁美洲、非洲及亚洲等人群，其中MODY2、 MODY3比率最高，分别占全部MODY家系的7% ～ 63%，11.5% ～ 73%，尤其是欧洲白种人MODY家系，高达50%以上均为GCK及HNF-1α基因突变所致[4-7]。而日本[8]及我国香港[3]的研究人群中，MODY的发生率则远远小于欧洲白人。中国香港145例早发糖尿病患者中[3]，仅有4%为MODY2，5%为MODY3。

　　中国大陆地区自上个世纪90年代才开始MODY的研究，最早由项坤三等[9]对30例45岁或以前发病伴糖尿病家族史的中国人进行GCK基因突变的扫查，但未发现突变。近年，北京、上海报道了各自MODY筛查的结果，只有上海发现一例MODY5[10]。

　　本研究对19例早发2型糖尿病家系检测MODY 1-5基因，未发现突变。位于MODY3基因(HNF-1α)启动子区的-302 C > T变异曾由Lehto等[2]在115例有明显家族史的早发型糖尿病家系先证者中发现了1例，但在92例正常对照者中未发现，即该变异极少见。我们对具有启动子区 -302 C > T变异的一个家系进行调查，结果显示，该变异与糖尿病并非共分离。故启动子区 -302 C > T变异是一少见的多态性。MODY3基因(GCK)IVSnt1bnt + 12A > T变异发生在肝脏特异性1 b的内含子区，既往学者[9]发现在中国人的2型糖尿病者尤其是起病早及伴有明显糖尿病家族史中，可伴该变异，但未见于正常糖耐量者。我们对该家系进行调查，发现先证者的变异基因来自其患糖尿病的母亲，而糖耐量正常的父亲和妹妹不带有该变异。由于该变异位于内含子区，且并非剪接位点，一般位于内含子区的碱基替换不会影响基因表达，故我们认为，该变异是一种少见的多态性。

　　以上结果提示MODY基因突变的分布在不同种群中存在较大异质性。这些差异可能是在漫长的进化过程中，自然选择对某些基因位点所起的作用不同，从而导致基因突变分布频率的地域性差异。此外，近年有研究显示MODY基因的多态性增加了2型糖尿病发生的危险(如HNF-1α I27L)[11-12]，本研究在19个家系先证者中发现多种多态性，这些多态性很可能参与了家族中糖尿病的发生。

　　3.2 可能存在MODY-X基因或2型糖尿病主效基因

　　研究发现，相当比例表现为单基因遗传的家系(即使是符合MODY诊断标准)，虽有部分系线粒体基因或MODY基因突变所致，但仍有相当比例家系的致病基因未明。这些家系(MODY gene-negative，许多研究称其为MODY-X)表现出明显的家族聚集性和糖尿病的早发，进一步分析其临床特征，发现与MODY患者相比较，其诊断年龄稍晚，BMI较高，并具有胰岛素抵抗的某些特征(相对高的甘油三酯和胰岛素水平，相同C肽情况下需更多外源性胰岛素治疗)[13]。即这些MODY-X家系并不具有典型的MODY的特点，而是更倾向于传统的2型糖尿病，由于其遗传模式上表现为孟德尔遗传，故推测其可能是早发的单基因遗传的2型糖尿病，也许存在主效基因参与发病。

　　本研究对19个早发型糖尿病家系先证者的临床表型进行分析，显示了相对大的诊断年龄、BMI和相对高的血脂水平，与文献中提及的MODY-X有相似之处(表2)，这些提示19个家系中可能存在MODY-X基因或2型糖尿病主效基因。尤其是家系CAO，这个高度外显的家系尽管平均诊断年龄较晚，但所表现出的家族聚集性提示很可能存在某一主效基因突变，使家系成员大部分受累。如何在这些家系中寻找可能存在的主效基因是值得进一步研究的问题。

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