饮食对胰岛素抵抗大鼠脂肪组织中糖原合成酶激酶3β表达的影响

　　作者：张丽锋 毕会民 王行富 作者单位：福建省级机关医院内分泌科，福建 福州 350003

　　【摘要】 目的 探讨饮食治疗对胰岛素抵抗大鼠脂肪组织中糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)表达的影响。方法 30只SPF级雄性Wistar大鼠随机分为2组，正常对照组(10只，常规饲料喂养)、模型组(20只，高脂饲料喂养;4 w后模型形成)。模型组随机分为2个亚组(胰岛素抵抗组和饮食干预组，每组10只)，胰岛素抵抗组继以高脂饲料喂养，饮食干预组给予普通饲料喂养。6 w后，用Western-blot方法检测各组大鼠附睾脂肪组织中GSK-3β的表达，对比各组的表达差异;定期检测大鼠体重、空腹血糖及血浆胰岛素、血甘油三酯和胆固醇，并计算胰岛素敏感指数。结果 高脂饲料喂养4 w后，与正常对照组比较，模型组大鼠体重、空腹血糖、胰岛素、胆固醇、甘油三酯显著升高(P<0.05或P<0.01),胰岛素敏感指数显著下降(P<0.01﹚，胰岛素抵抗模型诱导成功;饮食干预6 w后与胰岛素抵抗组大鼠比较，脂肪组织中GSK-3β的表达显著下降(P<0.05﹚;与正常对照组比较，差异无统计学意义。结论 饮食干预能改善大鼠机体胰岛素抵抗，可能与下调脂肪组织GSK-3β的表达有关。

　　【关键词】 糖原合成酶激酶3β;胰岛素抵抗;脂肪组织;饮食治疗

　　The effect of diet on glycogen synthase kinase 3 β expressions in fatty tissue of insulin resistance rats

　　ZHANG Li-Feng, BI Hui-Min, WANG Xing-Fu.

　　Department of Endocrinology, Fujian Province Governmental Hospital, Fuzhou 350003, Fujian, China

　　【Abstract】 Objective To explore the effect of diet on glycogen synthase kinase 3 β expressions in adipocyte of insulin resistance (IR) rats induced by high-fat diet.Methods 30 SPF male Wistar rats were randomly divided into normal control (n=10, routine forage feeding) and model group (n=20, high lipid feeding; established 4 w later). The model groups were randomly divided into 2 subgroups (IR group fed with high lipid and diet intervention group fed with routine diet, 10 rats in each group). The expression of glycogen synthase kinase (GSK) 3 β in fatty tissue of epididymis in all groups were detected by Western blotting. Body weight (BW),serum triglyceride (TG) and cholesterol (TC), fasting plasma glucose (FPG) and serum insulin concentration were detected termly and insulin sensitivity index (ISI) was calculated. Results ①After fed with high fat diet for 4 w, BW, FPG, insulin, TC and TG obviously increased (P<0.05 or <0.01), ISI significantly decreased (P<0.01) in model group comparing to those in normal control group, showing successful IR model.GSK-3β expression decreased obviously in fatty tissue in diet intervention group comparing to that in IR group (P<0.05), but had no difference from that in normal control group. Conclusions Diet intervention could improve IR of the rats, being related to down-regulating GSK-3β expression in fatty tissue.

　　【Key words】 Glycogen synthase kinase 3 β;Insulin resistance (IR);Adipocyte; Diet treatment

　　胰岛素抵抗综合征(又称代谢综合征)是以向心性肥胖、糖耐量异常或2型糖尿病、高血压、动脉粥样硬化等为主要临床表现的一组疾病，胰岛素抵抗(IR)是其病理生理基础;胰岛素受体后信号转导异常又是IR发生的重要机制，其中胰岛素受体后信号蛋白之一糖原合成酶激酶3(GSK-3)对IR发生起重要作用，其同种异构体分别为GSK-3α(51 kD)、GSK-3β(46 kD)，均对胰岛素信号转导起负性调节作用〔1，2〕。许多研究显示，除遗传因素外，高脂肪、低碳水化合物膳食与IR及糖尿病的发生有密切关系〔3〕。合理的饮食是治疗IR的基本措施〔4〕;适当控制饮食、增加体力活动，可降低2型糖尿病的发病率30%～50%〔5〕。饮食改善IR的机制目前研究较多集中在脂联素、抵抗素等细胞因子方面，本研究旨在从胰岛素信号系统方面阐明饮食治疗改善IR甚至糖尿病的机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 SPF级Wistar雄性大鼠购于湖北省预防医学科学院实验动物中心〔合格证号：SCXK(鄂)2003-0005〕。胰岛素放免分析试剂盒(中国原子能科学研究院同位素研究所)，PMSF、pepstatin、leupeptin、aprotinin均购于Sigma公司;GSK-3β多克隆抗体(Santa Cruz Biotechnology)，辣根过氧化物酶标记羊抗兔二抗(武汉凌飞生物技术有限公司)，ECL试剂盒(Pierce)，优越血糖仪AdvantageII(美国罗氏诊断公司)，美国BeckmanCXT型全自动生化分析仪，电泳仪(Bio-rad公司 Mini-PROTEAN3 cell 525BR)及电转仪(Bio-rad公司 Mini Trans-Blot cell 153BR)，Bio-Profit凝胶成像系统及Bio-1D图像分析软件(法国VL)。

　　1.2 模型建立 SPF级雄性6周龄Wistar大鼠30只，体重165～180 g，随机分2组，正常对照组10只，模型组20只，均适应性喂养1 w后，模型组高脂饲料喂养:脂肪热比为59 %(其中猪油占39 %)，蛋白质热比为21%,碳水化合物热比为20 %(其中玉米淀粉占30 %)，此外附加必需维生素及矿物质，每只大鼠每天供给的总热量约310 kJ〔6〕。对照组常规饲料(武汉大学医学院实验动物中心提供)喂养，两组大鼠摄取的能量基本相同。所有大鼠均饲养于标准环境，自由摄食，12 h光照周期(6AM开始照明)。喂养4 w后根据相应指标(空腹血糖、空腹血浆胰岛素、血脂、胰岛素敏感指数等)判断模型诱导成功。胰岛素抵抗模型形成后，随机分为两亚组：胰岛素抵抗组(10只)，继续以高脂饲料喂养;饮食干预组(10只)，以常规饲料喂养。3组动物均继续喂养6 w。

　　1.3 测定指标

　　1.3.1 体重(BW)、甘油三酯(TG)、胆固醇(TC)、空腹血糖(FPG)、空腹血浆胰岛素(FINS)水平测定 分别于实验第1、5及11周大鼠清晨空腹状态下，电子天平称重，麻醉(腹腔注射1%戊巴比妥，40 mg/kg)后心脏采血，血液离心后取上清用CXT型全自动生化分析仪测定TG、TC;用优越血糖仪AdvantageⅡ测定FPG;放免试剂盒测定FINS;并计算胰岛素敏感指数ISI=In〔1/(FPG×FINS)〕。

　　1.3.2 样本制备 实验动物麻醉处死后迅速分离其附睾脂肪垫，以预冷(4℃)PBS洗后称重，每1 g组织加入10 ml裂解液(10 mmol/L Tris-HCl，pH7.5，1 mmol/L EDTA，10 mmol/L NaF,1 mmol/L DTT,0.5 mmol/L sodium orthovanadate,0.2 mmol/L PMSF,10 μg/mL aprotinin,20 μg/ml leupeptin，0.5% Triton X-100),机械匀浆，匀浆液离心(1 000 g,20 min),所得上清液以玻璃滤纸过滤,去除残余组织,滤过液再次离心(10 000 g,20 min),取上清液;以上操作均在4℃进行。上清液分装置于-80℃保存。

　　1.3.3 GSK-3β表达测定 考马斯亮兰蛋白测定试剂盒测定各样本蛋白含量，调整各样本蛋白浓度一致。将等量样品经SDS-PAGE(12%)电泳分离后，转印到硝酸纤维素(NC)膜上，洗膜后以封闭液室温封闭1 h，与GSK-3β多克隆抗体4℃下孵育12 h，漂洗后再加入辣根过氧化物酶结合的二抗，室温下孵育1.5h，充分漂洗后与ECL试剂反应5 min,立即用Kodak底片曝光洗片。底片经凝胶成像系统扫描分析灰度值，对比各组GSK-3β表达的相对含量。

　　1.4 统计学处理 实验数据用SPSS11.5统计软件分析，所有结果用x±s表示，两组间均数比较采用t检验，多组间均数比较采用单因素方差分析。

　　2 结果

　　2.1 各组大鼠一般指标的动态观察结果 大鼠适应性喂养1 w，各组BW、FPG、FINS、TG、TC、ISI无显著差异。经高脂饲料喂养4 w后，与正常对照组比较，模型组BW、FINS、TG、TC升高(P<0.01),FPG也升高(P<0.05)，而ISI下降(P<0.01)(表1)。胰岛素抵抗组继以高脂饲料喂养，同时饮食干预组喂以常规饲料。6 w后与正常对照组比较，胰岛素抵抗组BW、FPG、FINS、TG、TC升高(P<0.01)，ISI降低(P<0.01);饮食干预组BW、FINS、TG、TC升高(P<0.01)，ISI降低(P<0.01)。饮食干预6 w后，与胰岛素抵抗组比较，BW、FPG、TG、TC均降低(P<0.01);ISI升高(P<0.05);FINS的变化无统计学意义。饮食干预可降低FPG、BW、TG和TC，升高ISI，改善高血糖、高血脂以及胰岛素抵抗(表2)。

　　2.2 各组大鼠脂肪组织GSK-3β表达含量的比较 胰岛素抵抗组大鼠脂肪组织GSK-3β蛋白条带扫描后灰度值(25 412.8±8 301.3)高于正常对照组(10 334.4±3 242.9)(P<0.05);饮食干预组(14 171.6±4 183.5)低于胰岛素抵抗组(P<0.05);饮食干预组和正常对照组比较，差异无统计学意义。提示胰岛素抵抗大鼠脂肪组织GSK-3β的表达较正常对照组明显增高，经饮食干预治疗后，其脂肪组织GSK-3β的表达下降(图1、2)。

　　表1 高脂饮食4 w后模型组和对照组一般指标比较(略)

　　与对照组比较：1)P<0.05，2)P<0.01

　　表2 饮食干预6 w后各组大鼠一般指标比较(略)

　　与正常对照组比较：1)P <0.01;与胰岛素抵抗组比较：2)P <0.05,3)P<0.01

　　D饮食干预组 I胰岛素抵抗组 C正常对照组

　　图1 Western-blot测定脂肪组织GSK-3β的表达(略)

　　图2 GSK-3β表达的相对含量(略)

　　3 讨论

　　含高饱和脂肪的膳食(主要为动物性食品)早已被证明可增高血总胆固醇和低密度脂蛋白(LDL)胆固醇水平，并通过脂联素、炎性因子等作用改变体脂分布，降低糖耐量，并可引起胰岛素抵抗〔7〕，从而增加了糖尿病及心血管疾病发病的危险性。钟建庭等〔8〕研究发现伴高血脂症的2型糖尿病患者较血脂正常组的ISI 显著降低,而FINS 显著增高,表明2型糖尿病合并高血脂患者有更高的高胰岛素血症和更显著的胰岛素抵抗。血脂与ISI之间相关分析表明，随着血脂升高ISI逐渐下降，故TC、TG、LDL-C增高为胰岛素抵抗的特征。

　　GSK-3β在胰岛素信号转导中的负性调节作用主要是通过两条途径：磷酸化GS(糖原合成酶)的Ser640位点和IRS-1(胰岛素受体底物-1)的Ser332位点实现的〔1，2，9〕。糖原合成是胰岛素刺激葡萄糖代谢的重要途径，2型糖尿病时糖原合成受损，GS是糖原合成的限速酶，而且在2型糖尿病患者中，GS活性明显减少〔10〕，GSK-3β表达可减少基础葡萄糖摄取，也减少胰岛素刺激的葡萄糖摄取或葡萄糖转运体(GLUT4)转运〔11〕。体内外实验均显示胰岛素可以通过丝氨酸(ser9位点)磷酸化使GSK3β失活。过度表达GSK-3β的转基因小鼠的血浆胰岛素、血胆固醇、非饱和脂肪酸、甘油三酯水平明显增高，糖原合成、IRS-1水平明显下降，并导致IGT〔12〕。具胰岛素样作用物锌能增加GS活性及葡萄糖的摄取，可能由其直接抑制GSK-3β而介导〔13〕。以上多项研究表明了GSK-3β在胰岛素的信号转导及调节糖代谢方面的作用，GSK-3β的抑制剂现成为胰岛素抵抗治疗方面新的研究方向，国内尚无关于GSK-3β在胰岛素抵抗以及糖尿病发病机制中的作用的报道;本研究中胰岛素抵抗模型组大鼠 GSK-3β的表达显著高与正常对照组，证实了GSK-3β在胰岛素生理作用中的负性作用。

　　合理膳食可以减轻体重，改善高脂血症，而且Martin〔14〕等研究发现低脂饮食较限制饮食的总热量对于IR更有利。研究发现不管是皮下脂肪还是内脏脂肪都分泌TNF-6或抵抗素等导致或加重IR，此外肥胖者体内脂联素减少等有关因素也可能引起或加重IR，而低脂饮食可能改善这些因子的分泌异常〔15，16〕。在胰岛素信号转导方面的研究发现高脂饮食导致胰岛素抵抗与减少了Akt的磷酸化有关〔17〕;高脂饮食增加胰岛素受体和IRS-2的丝氨酸磷酸化而对胰岛素信号转导起负性影响〔18〕;减少饮食中脂肪比重可以改善上述受体及受体后信号蛋白的磷酸化状态而改善IR状态。此外饮食可降低胰岛素抵抗大鼠肝脏组织中蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP 1B) 的表达〔19〕。目前尚无关于饮食对胰岛素信号后负性因子GSK-3β表达的影响的研究报道，本实验中观察到饮食干预可以改善高血脂、高血糖、高胰岛素血症，增加胰岛素敏感指数，明显改善胰岛素抵抗;并且饮食干预可显著降低GSK-3β的表达。证实了饮食干预改善胰岛素抵抗的确切疗效，并在胰岛素受体后信号蛋白方面阐明了饮食干预改善胰岛素抵抗的机制，可能与降低GSK-3β的表达有关。今后可进一步研究饮食干预对GSK-3β上下游信号蛋白的影响，阐明其改善IR的确切机制。

　　【参考文献】

　　1 Liberman Z，Eldar-Finkelman H.Serine 332 phosphorylation of insulin receptor substrate-1 by glycogen synthase kinase-3 attenuates insulin signaling〔J〕.J Biol Chem，2005;280(6):4422-8.

　　2 Eldar-Finkelman H，Krebs EG.Phosphorylation of insulin receptor substrate 1 by glycogen synthase kinase 3 impairs insulin action〔J〕.Proc Natl Acad Sci，1997;94:9660-4.

　　3 王燕芳.膳食营养与Ⅱ型糖尿病〔J〕.中华预防医学杂志，1999;33(4):244-7.

　　4 傅祖植，王佑民.2型糖尿病的综合治疗〔J〕.中华内分泌代谢杂志，2000;16(6)：389-92.

　　5 潘长玉.近年来我国内分泌学的研究进展〔J〕.中华内科杂志，1999;38(9)：587-90.

　　6 都 健，赵玉岩，谢 辉,等.喂养型胰岛素抵抗动物模型的建立与评价〔J〕.中国医科大学学报，2002;31(5)：343-6.

　　7 Zhang H，Chen XL，Aravindakshan J,et al.Changes in adiponectin and inflammatory genes in response to hormonal imbalances in female mice and exacerbation of depot selective visceral adiposity by high-fat diet：implications for insulin resistance〔J〕.Endocrinology，2007;148：5667-79.

　　8 钟建庭，席春生,鞠 英，等.2型糖尿病脂代谢与胰岛素抵抗的分析〔J〕.中国现代医学杂志，2003;13(21):92-3.

　　9 Parker PJ，Caudwell FB，Cohen P.Glycogen synthase from rabbit skeletal muscle:effect of insulin on the state of phosphorylation of the seven phosphoserine residues in vivo〔J〕.Eur J Biochem，1983;130:227-34.

　　10 Hojlund K,Frystyk J,Levin K,et al.Reduced plasma adiponectin concentrations may contribute to impaired insulin activation of glycogen synthase in skeletal muscle of patients with type 2 diabetes〔J〕.Diabetologia，2006;49(6)：1283-91.

　　11 Wang Y，Roach PJ.Inactivation of rabbit muscle glycogen synthase by glycogen synthase kinase-3：dominant role of the phosphorylation of Ser-640 (site-3a)〔J〕.J Biol Chem，1993;268：23876-80.

　　12 Pearce NJ，Arch JR，Clapham JC,et al.Development of glucose intolerance in male transgenic mice overexpressing human glycogen synthase kinase-3 beta on a muscle-specific promoter〔J〕.Metabolism，2004;53(10)：1322-30.

　　13 Ilouz R，Kaidanovich O，Gurwitz D,et al.Inhibition of glycogen synthase kinase-3 beta by bivalent zinc ions：insight into the insulin-mimetic action of zinc〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，2002;29(1)：102-6.

　　14 Martin M，Jong MC，Mensink RP,et al.A low-fat diet has a highter potential than energy restriction to improve high-fat diet induced insulin resistance in mice〔J〕.Metabolism，2002;51(6)：695-701.

　　15 Hotamisligil GS，Arner P，Caro JF,et al.Increased adipose tissue expression of tumor necrosis factor-alpha in human obesity and insulin resistance〔J〕.J Clin Invest，1995;95：2409-15.

　　16 Arita Y，Kihara S，Ouchi N,et al.Paradoxical decrease of an adipose-specific protein，adiponectin,in obesity〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，1999;257:79-83.

　　17 Walker PC，Park SY，Cho YR,et al.High fat diet-induced cardiac insulin resistance is due to reduced Akt phosphorylation and blunted-adiponectin levels.65th Annual Meeting of the American -Diabetes-Association〔J〕.Diabetes，2005;54 (Suppl.1)：A339.

　　18 Souza D，Claudio T，Eliana P,et al.Consumption of a fat-rich dietactivates a proinflammatory response and induces insulin resistance in the hypothalamus〔J〕.Endocrinology，2005;146(10)：4192-9.

　　19 李建辉，毕会民，李 枫.饮食降低胰岛素抵抗大鼠肝脏组织中PTP1B的表达〔J〕.中国医师杂志，2004;6(12)：1612-4.