灵芝多糖对糖尿病大鼠肾组织MMP-2和TIMP-2表达的影响

　　作者：李伟 毛春谱 殷寒秋 作者单位：徐州医学院附属医院内分泌科，徐州 江苏 221002

　　【摘要】 目的 观察基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、基质金属蛋白酶抑制因子-2(TIMP-2)在糖尿病大鼠肾组织中的表达及灵芝多糖干预后的影响。方法 腹腔注射链脲佐菌素(STZ)诱导制备糖尿病大鼠模型，分组给予不同剂量灵芝多糖(GLP，100、200、400 mg/kg)进行治疗性灌胃。8 w后，免疫组化和RT-PCR方法检测各组大鼠肾皮质MMP-2、TIMP-2的表达。结果 糖尿病组大鼠肾小球MMP-2的表达较正常对照组明显减少，TIMP-2明显升高(P<0.01);灵芝多糖各组较糖尿病组MMP-2表达升高(P<0.01)，TIMP-2表达减少(P<0.01)。结论 灵芝多糖通过调节MMP-2/TIMP-2的平衡，减少细胞外基质积聚，对糖尿病大鼠肾脏起保护作用。

　　【关键词】 灵芝多糖;糖尿病肾病;基质金属蛋白酶-2;基质金属蛋白酶抑制因子-2

　　基金项目：江苏省中医药局资助项目(H05102)

　　Effects of Ganoderma lucidum polysaccharides on the expression of matrix metalloproteinase-2/tissue inhibitor of metalloproteinase-2 in diabetic rat kidney

　　LI Wei，MAO Chun-Pu, YIN Han-Qiu.

　　Department of Endocrinology，Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College，Xuzhou 221001，Jiangsu, China

　　【Abstract】 Objective To investigate the expressions of matrix metalloproteinase (MMP)-2 and tissue inhibitor of metalloproteinase (TIMP)-2 in the kidney of diabetic rats and the effects of Ganoderma lucidum polysaccharides on such changes.Methods 70 male Sprague-Dawley rats were divided randomly into control group (n=10)，diabetes mellitus (DM) group (n=15) and three dosages (100, 200 and 400 mg/kg) of Ganoderma lucidum polysaccharides (GLP) treated diabetic groups (each group, n=15). Diabetic model was induced by intraperitoneal injection of streptozotocin (STZ) (60 mg/kg). The expressions of MMP-2 and TIMP-2 in kidney tissure were determined by immunohistochemistry and RT-PCR methods 8 weeks later. Results The expressions of protein and mRNA MMP-2 significantly reduced in glomeruli，while expressions TIMP-2 was increased in DM group(P<0.01) compared with those in control group. MMP-2 expression increased and TIMP-2 expression decreased in all dosages of GLP groups compared with those in DM group (P<0.01). Conclusions GLP has some renal protective effect on diabetic rats through decreasing excessive deposition of glomeruli extracellular matrix by regulating the bachance of MMP-2 and TIMP-2.

　　【Key words】 Ganoderma lucidum polysaccharides;Diabetic nephropathy;Matrix metalloproteinase-2;Tissue inhibitor of metalloproteinase-2

　　糖尿病肾病(Diabetic nephropathy，DN)是糖尿病患者致残致死的重要原因之一。目前防治DN的药物主要是以西药为主，且副作用较多。灵芝多糖(Ganoderma lucidumpolys accharides，GLP)是从灵芝中提取的有效活性成分，具有广泛的药理活性〔1〕，能调节机体的免疫力，抗肿瘤，抗辐射等作用。近年来研究表明GLP具有减少尿微量白蛋白(microalbuminuria，MAU)〔2〕、降低血脂(plasma fat，PF)〔3〕、消除机体内自由基和抗氧化〔4〕等作用，提示GLP对肾脏具有一定的保护作用。但是GLP是否能通过MMP-2 /TIMP-2的作用机制发挥肾脏保护作用，国内外未见报道。本研究采用免疫组化和RT-PCR方法的方法观察GLP不同剂量组对糖尿病大鼠肾组织的MMP-2和TIMP-2的表达变化，旨在探讨GLP对DN的作用机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 清洁级雄性SD大鼠70只，体重180～220 g(徐州医学院实验动物中心)，STZ(美国Sigma公司)，灵芝多糖(河北保定施达科生物工程技术有限公司，批号：RM051215)。一抗分别为兔抗大鼠 MMP-2、TIMP-2(武汉博士德生物工程有限公司)抗体，SP-6001试剂盒及DAB试剂盒 ( 北京中杉金桥生物技术有限公司)，Total RNA提取试剂、RT-PCR 试剂盒(大连宝生生物有限公司)，LEICA Qwin图像处理与分析系统(德国)，罗氏血糖仪(上海罗氏公司)，日立7600型全自动生化分析仪(日本日立公司)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 模型的建立 将SD大鼠随机分为正常对照组(C组，n=10)、糖尿病组未治疗组(DM组，n=15)、灵芝多糖低剂量组(GL-1组，n=15)、灵芝多糖中剂量组(GL-2组，n=15)、灵芝多糖高剂量组(GL-3组，n=15)，分笼饲养。DM组和GL-1、GL-2、GL-3组大鼠在禁食12 h后，于左下腹腔一次性注射STZ(溶于0.1 mmol/L柠檬酸缓冲液，pH4.4)60 mg/kg，72 h后，尾静脉采血测随机血糖≥16.7 mmol/L，持续3 d以上作为模型纳入本实验。C组仅予以等量柠檬酸缓冲液腹腔注射。60只大鼠经检测均造模成功。

　　1.2.2 给药方法 模型成立3 d后GL-1、GL-2、GL-3组分别给予灵芝多糖水溶液100、200、400 mg/kg剂量进行治疗性灌胃，C组和DM组用等体积生理盐水灌胃。所有大鼠实验期间自由饮水进食，不使用胰岛素及其他降糖药物。每隔1 w测量体重(BW)以调整用药量，实验过程中DM组死亡4只，GL-1组死亡4只，GL-2组死亡5只，GL-3组死亡2只，其中GL-2组2只撕咬致死，其余可能为酮症酸中毒所致。

　　1.2.3 标本收集 连续观察8 w后收集标本。代谢笼中收集24 h尿，离心保存于-20℃的冰箱待测尿微量白蛋白(MAU)。称量体重后，用10%水合氯醛麻醉，腹主动脉采血测血糖(BG)、糖化血红蛋白(GHbA1c)、尿素氮(BUN)、血肌酐(SCr)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)。用4℃冰冷生理盐水冲洗后摘除双肾，去包膜滤纸吸干血迹后称重左肾，左肾重(KW)和体重的比值作为肾脏指数(KI)的指标。左肾部分置于10%中性福尔马林中固定，用以光镜、免疫组织化学研究。右肾取皮质1 mm×1 mm×1 mm标本放入3%戊二醛中固定，留作电镜研究;余肾皮质置DEPC水处理过的EP管，液氮冻透后保存于-70℃的冰箱待测RT-PCR。

　　1.2.4 生化指标的测定 MAU采用胶体金双抗体夹心法检测，BG采用葡萄糖氧化酶法检测，GHbA1c采用亲和层析法检测，BUN、SCr、TC、TG由日立7600型全自动生化分析仪检测。

　　1.2.5 常规光镜检测 肾组织经10%福尔马林固定，常规脱水、包埋，切片厚4 μm，行HE染色和免疫组化。

　　1.2.6 透射电镜检测 肾皮质经固定，脱水，浸透，包埋，制备半薄及超薄切片，电镜观察。

　　1.2.7 免疫组化 采用SP二步法，石蜡切片厚4 μm后常规脱蜡至水，3%H2O2阻断内源性过氧化物酶后，微波加热暴露抗原，滴加一抗(1∶50)，4℃冰箱过夜，PBS洗片后滴加二抗，37℃孵育1 h，DAB显色控制在3～5 min，复染、脱水、透明、封片。以吸光度值(OD)表示，显色强度用LEICA Qwin图像处理与分析系统进行分析，以每张切片随机取10个视野的肾小球进行半定量分析。

　　1.2.8 RT-PCR 由基因库分别查得大鼠MMP-2、TIMP-2及β-actin的mRNA核苷酸序列，PCR引物用Primer Premier引物设计软件设计，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。肾组织总RNA的提取采用二步提取法，RT-PCR反应严格按照产品说明进行，MMP-2引物：上游5′-TTCCCCCGCAAGCCCAAGTG-3′(634～653)，下游5′-GAGAAAAGCGCAGCGGAGTGACG-3′(756～778)，产物145 bp，Genbank 登记号( NM008610)。反应参数为：预变性94℃3 min，变性94℃45 s，退火62℃45 s，延伸72℃45 s，循环35轮，然后72℃延伸10 min，4℃终止;TIMP-2引物：上游5′-TGCAGCTGCTCCCCGGTGCAC-3′ (400～420)，下游5′-TGCTGAAGAGGGGGCCGTGTAGAT-3′(586～609)，产物210 bp，Genbank 登记号(NM011594)。反应参数为：预变性94℃3 min，变性94℃45s，退火64℃45s，延伸72℃45s，循环30轮，然后72℃延伸10 min，4℃终止。β-actin(与MMP-2、TIMP-2共扩增做内参照)：上游5′-CAGAAGGACTCCTACGTG(226～243)-3′,下游5′-GCTCGGTCAGGATCTTCATG(648～667)-3′,产物442 bp，Genbank 登记号(NM031144)。取PCR扩增产物5 μl在1.5%琼脂糖中电泳，Imagemaster VDS 成像系统摄影存盘后应用计算机图像分析软件(TotallabV 1.01) 行灰度扫描分析。以目的基因与β-actin 的PCR产物条带灰度Volume之比作为反映目的基因mRNA水平的相对指标。

　　1.3 统计学处理 计量资料用x±s表示，应用SPSS13.0统计软件进行统计分析，组间比较采用单因素方差分析。

　　2 结果

　　2.1 一般情况 DM组大鼠在实验期间多饮、多尿、多食、体重减轻、毛色无光泽、生长发育迟缓等症状十分明显，GLP各组大鼠上述症状改善不明显。8 w时DM组于C组相比，BG、KI、GHbA1c、BUN、TC、BUN、MAU显著升高，而KW明显下降(P<0.01)，TC各组差异无统计学意义，GLP各组治疗后BW增加，KI降低，TC、BUN、MAU指标明显改善，尤以GL-3组明显(P<0.01，P<0.05)，但BG、GHbAlc、SCr、TG无显著差异，见表1。

　　2.2 形态学改变 DM组大鼠较C组系膜细胞显著增生，系膜基质增多，肾小动脉内膜增生，管壁增厚，毛细血管腔狭窄，GL各组较DM组上述病理改变有不同程度改善。见图1。

　　2.3 肾脏超微结构改变 透射电镜下显示C组肾小球毛细血管基底膜呈线性状，厚度均匀，足状突起排列有序，无足突融合，系膜基质不增多;DM组基底膜增厚显著增厚、不规律，并且可见上皮细胞的足突融合，系膜基质显著增多。上述病理改变在GLP各组有不同程度的改善(图2)。

　　表1 灵芝多糖对糖尿病大鼠BG、BW、KW、KI、GHbAlc、TC、TG、SCr、BUN、MAU的影响(略)

　　与C组比较：1)P<0.05，2)P<0.01;与DM组比较：3)P<0.05，4)P<0.01;与GL-1组比较：5)P<0.05，6)P<0.01;与GL-2组比较：7)P<0.05，8)P<0.01;下表同

　　2.4 免疫组化结果 免疫组化染色显示阳性颗粒主要定位于肾小球和肾小管，DM组较C相比MMP-2降低而TIMP-2升高(P<0.01);GLP各组较DM组相比MMP-2均升高而TIMP-2不同程度降低(P<0.01)，见表2及图3。

　　2.5 RT-PCR结果 8 w时，与C组相比DM组MMP-2mRNA表达减少，而TIMP-2mRNA表达增多;与DM组相比GLP各组MMP-2mRNA表达升高而TIMP-2mRNA表达减少(P<0.01)，见表2及图4。

　　表2 灵芝多糖对各组糖尿病大鼠MMP-2和TIMP-2表达的影响(略)

　　图1 肾小球形态学变化(HE，×400)(略)

　　图2 肾小球超微结构变化(略)

　　图3 肾皮质MMP-2/TIMP-2免疫组化表达变化(SP二步法，×400)(略)

　　1.GL-3组，2.GL-2组，3.GL-1组，4.DM组，5.C组，M.DNA marker

　　图4 MMP-2、TIMP-2和β-actin的RT-PCR产物(略)

　　3 讨论

　　DN的主要病理特征是基底膜增厚和系膜区细胞外基质(extracelluar matrix，ECM)堆积，逐渐导致肾小球硬化。ECM主要由Ⅳ型胶原、层黏连蛋白、纤维连接蛋白等组成，其积聚和降解的平衡失调是导致肾小球硬化的关键病理过程之一〔5〕。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是在降解ECM起着主要的作用。MMPs是含有金属离子锌的蛋白酶超基因家族，能降解除多糖以外的所有ECM的成分。按作用底物可将MMPs分为四类：胶原酶、白明胶酶、基质溶解酶、膜型MMPs。MMP-2属于白明胶酶，在肾小球系膜细胞、内皮细胞、成纤维细胞等均有表达，主要降解Ⅳ型胶原。其活性受特异性抑制因子TIMP-2影响〔6〕。MMP-2/TIMP-2之间的平衡在调节ECM的降解中起着重要的作用。

　　一般认为在高血糖状态下肾小球MMP-2的表达减少而TIMP-2的表达增加，近年来研究证明MMP-2/ TIMP-2的动态失衡机制可能是：(1)高血糖直接引起血管紧张素2(AngⅡ)上调，Ang Ⅱ对肾小球系膜细胞的作用由血管紧张素1受体(AT1)受体介导,从而影响MMP-2/TIMP-2的平衡〔7〕;(2)高血糖可通过上调转化生长因子β1(TGF-β1)来抑制MMP-2的表达和活性同时上调TIMP-2的表达〔8〕;(3)糖尿病时结缔组织生长因子(CTGF)表达增加抑制MMP-2活性而升高TIMP-2〔9〕;(4)胰岛素样生长因子1(IGF-1)的表达水平升高，可使MMP-2的活性下降〔10〕;(5)糖尿病病人肾小球MMP-2的基因表达下调也可使MMP-2的表达减少〔11〕。但另有报道MMP-2的表达在糖尿病时是升高〔12〕和活性下降〔13〕。

　　本实验结果表明GLP对STZ诱导的糖尿病大鼠模型作用8 w后，肾小球MMP-2表达上调而TIMP-2的表达下调，同时MAU、KI、TC、BUN生化指标明显好转，电镜下基底膜增厚、系膜区增生和上皮细胞的足突融合等病变得到不同程度的改善，呈剂量依赖趋势，但对BG、GHbA1c、SCr、TG无明显作用。实验显示GLP可能是通过上调MMP-2和下调TIMP-2的表达来调节ECM的降解和合成达到对肾脏的保护作用，这种保护作用是独立于血糖之外的。此外GLP具有降低TC和减轻MAU的作用，减轻脂毒性和尿微量白蛋白对肾脏的损害而达到对肾脏的保护作用。

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