晚期糖基化终末产物受体与阿尔茨海默病

　　作者：丛潇 王友政 张文生 作者单位：北京师范大学资源学院资源药物与中药资源研究所 教育部资源药物工程研究中心，北京 100875

　　【关键词】 晚期糖基化终产物受体;阿尔茨海默病;β样淀粉蛋白

　　阿尔茨海默病(AD)是一种以记忆力下降和认知功能障碍为主要表现的神经退行性疾病，以形成细胞外淀粉样斑块，细胞内神经原纤维缠结及细胞慢性炎症为主要病理改变〔1〕。β样淀粉蛋白(Aβ)是一种易于聚集的非特异性结合蛋白，可与许多不同结构的物质相结合，如磷脂双分子层、蛋白聚糖以及多种蛋白受体，包括晚期糖基化终末产物受体(RAGE)、烟碱型乙酰胆碱受体α(αNAChR)，巨噬细胞A型清道夫受体(SRA)、α5β1整合素、N甲基D天冬氨酸受体(NMDA receptor)、p75 神经营养因子受体(P75NTR)及低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP1)〔2〕等。近年研究表明，Aβ在神经细胞外积累之前，就出现了记忆能力减退等临床症状同时发现脑内细胞突触大量丢失〔3，4〕，提示在AD早期阶段，Aβ单体或寡聚物通过与上述分子靶点结合后，激活相应的细胞内信号通路，最终导致氧化应激、神经元毒性等级联反应，可能是造成神经损伤的重要原因〔5〕。本文根据近年研究成果综述了细胞膜表面受体RAGE与AD发病的相关关系，为AD的治疗提供新思路。

　　1 RAGE的结构与分布

　　1992年，Neeper首次发现RAGE蛋白，由404个氨基酸组成，属于细胞表面免疫球蛋白超家族一员。RAGE是一种多配体受体，配体除晚期糖基化终末产物(AGEs)外，还发现有Aβ、神经轴突生长因子(Amphoterin)/高速泳动族盒1蛋白(HMGB I)、S100/钙粒蛋白，淀粉p肽以及甲状腺素转移酶(TTR)等，其共同特点是存在β片层以及纤维状结构〔6〕。人RAGE基因定位于6p21.3，含11个外显子。RAGE翻译后经系列加工处理，定位于细胞膜上，由信号肽、胞外域、跨膜区和胞内域四部分组成〔7〕。N端由22个氨基酸组成信号肽，胞外有3个Ig样区，包括N端的一个可变区和两个恒定区，使RAGE可与配体结合〔8〕。单次跨膜，胞内域富含电荷，能够结合多种细胞内信号分子。经过选择性剪接，人RAGE基因可产生多种异构体。如N端缺乏Ig可变区的异构体称为截去N段的RAGE，一般不能结合配体;缺乏C端跨膜区和胞内域序列的异构体称为可溶性RAGE(sRAGE)，其由胞内分泌，或由基质内金属蛋白酶剪切而成，其可结合RAGE配体，因此能与全长RAGE竞争配体;还有些异构体仅缺乏胞内域，仍固定于膜上，会引起显性负性效应，表现为配体失去介导信号转导和基因表达功能〔9〕。RAGE在单核巨噬细胞、血管内皮细胞、肾系膜细胞、神经细胞及平滑肌细胞等组织中普遍表达〔10〕。中枢神经系统中，RAGE主要存在于神经元，小胶质细胞以及构成血脑屏障的内皮细胞〔5〕，Sasaki等〔11〕用多克隆RAGE抗体检测发现RAGE多在海马神经元(尤其CA3，CA4区)核周体存在。

　　2 RAGE与A 的结合及细胞内信号通路

　　1996年，Yan等〔12〕用ELISA方法检测脑组织匀浆，首次发现AD患者脑中的RAGE表达过量，约为正常人脑的2.5倍，且在Aβ聚集域的血管壁中，RAGE表达量也显著升高。同时发现AD患者脑细胞内的Aβ，除部分由细胞自身生成外，还有部分是将之前分泌到细胞外的Aβ重吸收，再次内化到细胞内的。因此猜测，细胞外的Aβ是通过与细胞膜上的RAGE等受体结合，转运进入细胞。RAGE与Aβ单体和纤维状Aβ(Aβ Fibrils)均可以结合，Aβ侧链上的3Glu，7Asp，11Glu为RAGE的主要结合靶点。表面等离子共振(SPR)证明sRAGE与寡聚Aβ(Aβ Oligomers)亲和力强，与纤维状Aβ(Aβ Fibrils)亲和力相对弱。Natalia等〔13〕将转染RAGEEGFP的CHOk1、Neuro2a细胞和Texas红标记的AGEs共孵育3 h后，用共聚焦显微镜观察发现超表达的RAGEEGFP可以诱导小囊泡的形成，最终AGEsRAGE复合物内陷于细胞质膜，Aβ与RAGE结合后也可能通过类似途径进入细胞。RAGEAβ进入神经细胞后，激活包括NADPH氧化酶、p38MAPK、Cdc42、Rac等在内的信号转导途径，一方面通过激活NADPH氧化酶途径产生活性氧，一方面引起核转录因子(NFκB)和激活蛋白(AP1)转录靶基因。靶基因包括内皮素因子1(ET1)、血管细胞黏附分子1(VCAM1)，以及促炎症细胞因子IL1β、IL6、TNF 和RAGE本身。因此，RAGE与Aβ结合的主要信号转导机制是触发活性氧生成和上调炎症通路〔9〕，而NFκB的激活作为一种正反馈,会进一步促进配体与RAGE的结合;同时活性氧的生成也会放大配体的生成和加重炎症过程。此外，Origlia等〔14〕还发现RAGE将信号转到细胞内后，经p38MAPK信号转导途径会引发长时程增效(LTP)损伤，p38MAPK表达量增加，使特异性位点的tau蛋白磷酸化，最终促进神经原纤维缠结(NFT)形成〔15〕。

　　3 RAGE与血脑屏障(BBB)转运

　　正常生理条件下，BBB是大脑的天然保护层，其阻止血液中的Aβ进入中枢神经系统〔16〕，同时可将脑内产生的Aβ从脑间质液中清除出脑〔17〕。体外细胞培养实验表明，在一定时期，可溶的Aβ(140)单体可通过浸透的方式与脑血管内皮细胞的单层膜结合〔18〕。通过Aβ放射示踪实验和IgGRAGE特异的抗体封闭实验最终证实，Aβ是依赖于血管壁上的特异受体RAGE介导透过BBB〔19〕。RAGE存在于内皮细胞近血管壁，通过结合摄取血液中Aβ，经内吞和跨膜作用介导其通过BBB入脑。在AD患者和APP转基因动物模型中，RAGE在BBB上的表达显著上调，使更多的Aβ进入脑内。而Aβ沉积会刺激RAGE进一步表达增加，形成恶性循环。

　　4 RAGE与小胶质细胞活化

　　小胶质细胞(MG)是脑组织中的巨噬细胞，也是中枢神经系统的抗原提呈细胞和免疫效应细胞，具有吞噬细菌，抗原呈递，产生细胞因子和补体的能力。小胶质细胞在AD中有双重作用，一方面是AD早期损伤的主要细胞之一，另一方面又是“清道夫”，即其激活后可表现吞噬功能，有利于Aβ等有害物质的清除。研究表明，Aβ沉积是通过与受体的相互作用激活小胶质细胞的〔1〕，在小胶质细胞表面表达的RAGE、清道夫受体(SR)和丝氨酸蛋白酶抑制剂酶复合物受体(SECreceptor)等七种受体可介导小胶质细胞牢固地黏附于聚集的Aβ，从而引发小胶质细胞的活化〔9〕。Mattson〔20〕观察到纤维状Aβ与小胶质细胞表面的RAGE结合，激活小胶质细胞，使诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达，产生一氧化氮(NO)并激活肿瘤坏死因子α(TNFα)、转化生长因子β(TGFβ)等细胞毒性因子。Lue等〔21〕亦证实，在AD患者脑中，Aβ与小胶质细胞的RAGE结合，促使小胶质细胞向淀粉样斑块迁移、增殖，激活NFκB并分泌巨噬细胞集落刺激因子(MCSF)，引起炎症反应。而David等〔2〕发现，在Aβ孵育的小鼠小胶质瘤细胞BV2中加入MCSF后，MTT检测细胞活性不变，细胞形态完整，说明MCSF具有细胞保护作用。

　　5 RAGE与其他细胞反应

　　除小胶质细胞和神经元等神经细胞外，Aβ还可以与外周微血管内皮细胞，肥大细胞等细胞表面的RAGE结合，介导与AD相关的多种反应。在衰老情况下，RAGE可调节糖基化白蛋白(GA)诱导的线粒体损伤和肥大细胞凋亡。最近，Tetsuro等〔22〕发现，GARAGE结合引起线粒体内Ca2+超载，使线粒体膜破裂，进而导致超氧化物生成，细胞色素C释放，caspase3/7的激活，且剂量依赖性的导致肥大细胞凋亡。上述实验表明，RAGE作为广泛存在的细胞膜受体，在AD发病过程中，通过与Aβ相互作用，诱导神经元应激损伤，细胞因子释放以及介导Aβ穿越BBB等多种途径，成为介导Aβ损伤神经细胞的主要辅助因子〔23〕。

　　6 RAGE与AD治疗

　　近年研究表明，AD早期患者血清中的sRAGE浓度大大降低，因此sRAGE可被用来作为AD诊断的标志物〔24〕。由于sRAGE可与细胞膜上的RAGE竞争Aβ，且sRAGE不能穿过BBB，因此sRAGE与Aβ结合形成复合物可以将Aβ留在外周血中;当血浆中Aβ浓度降低后，脑内的Aβ就会向外周转移，从而减少脑内Aβ的沉积，减缓AD症状。给6月龄转基因小鼠TgmAPP注射sRAGE，每天100 g，3个月后海马内Aβ总量和Aβ(142)量分别降低了70%到78%〔19〕。进一步实验表明，延长给予sRAGE的时间，可以改善AD转基因鼠(TgmAPP/mPS1)的突触功能和空间工作记忆能力〔5〕。因此，用重组可溶性RAGE来抑制Aβ与RAGE的结合可成为开发AD药物的方向。用特异抗体封闭RAGE不同区段可能是一种新的治疗策略。封闭RAGE的Vd样区，可以减弱Aβ寡聚物(Aβ Oligomers)在SHSY5Y细胞和大鼠皮质细胞造成的神经毒性，而封闭RAGE的C1d样区却能抑制由Aβ聚集物(Aβ Aggregates)诱导的凋亡〔25〕。

　　除免疫方法外，一些中药单体对RAGE也有良好的干预作用。Yan等〔26〕发现银杏叶提取物EGb761可以降低大脑微血管内皮细胞中RAGE的表达，使Aβ不能通过BBB，从而减少了脑内的Aβ。向处于缺氧与低血糖状态下的鼠脑微血管内皮细胞系bEnd.3中加入100 μg/ml EGb761作用36 h后，RAGE mRNA及蛋白表达量均降低，一直持续到48 h。

　　综上所述，RAGE作为普遍存在于神经系统的膜受体，介导Aβ透过BBB、活化小胶质细胞、产生氧化应激、促进炎症反应并反馈上调自身表达，其导致的神经损伤与AD发病关系密切。基于RAGE在AD中的作用机制，通过降低RAGE表达水平、抗体封闭RAGE蛋白、竞争阻断RAGE与Aβ的相互作用以及抗氧化，抗炎症反应等方法可望寻求延缓AD的创新药物。而血清及脑脊液中RAGE或sRAGE水平的检测也可作为诊断早期AD的一种方法。

　　【参考文献】

　　1 Akiyama H，Barger S，Barnum S,et al.Inflammation and Alzheimer′s disease〔J〕.Neurobiol Aging，2000;21(3)：383421.

　　2 David D，Shelley JA.Neurobiology of Alzheimer′s disease〔M〕.3rd ed.Oxford University Press，2007：22733.

　　3 D′Hooge R，Nagels G，Westland CE.Spatial learning deficit in mice expressing human 751amino acid betaamyloid precursor protein〔J〕. Neuroreport，1996;7(1517):280711.

　　4 Ingelsson M，Fukumoto H，Newell KL,et al.Early Aβ accumulation and progressive synaptic loss，gliosis，and tangle formation in AD brain〔J〕. Neurology，2004;62(6)：92531.

　　5 Chen X，Walker DG，Schmiolt AM,et al.RAGE：a potential target for Aβmediated cellular perturbation in Alzheimer′s disease〔J〕.Curr Molecul Med，2007;7(8)：73542.

　　6 Schmidt AM，Yan SD，Yan SF,et al.The multiligand receptor RAGE as a progression factor amplifying immune and inflammatory responses〔J〕. J Clin Invest，2001;108：94955.

　　7 王瑞良,苏 青.RAGE及其配体的临床意义研究进展〔J〕.国际内分泌代谢杂志，2006;26(3):1602.

　　8 Chaneya MO,Stine WB，Kokjohn TA,et al.RAGE and amyloidbeta interactions：Atomic force microscopy and molecular modeling〔J〕.Biochim Biophys Acta，2005;174(12):199205.

　　9 陈 媛,周 玫.自由基炎症与衰老性疾病〔M〕.北京：科学出版社，2007：34271.

　　10 赵善超，刘靖华，李志杰，等.人晚期糖基化终产物受体胞质内段融合蛋白表达载体的构建与表达〔J〕.第一军医大学学报，2003;23(12)：13146.

　　11 Sasaki N，Toki S，Chowei H,et al.Immunohistochemical distribution of the receptor for advanced glycation end products in neurons and astrocytes in Alzheimer′s disease〔J〕.Brain Res，2001;888(2)：25662.

　　12 Yan SD，Chen X，Fu J,et al.RAGE and amyloidbeta peptide neurotoxity in Alzheimer′s disease〔J〕.Nature,1996;382(6593)：68591.

　　13 Sevillano N，Girón MD，Salido M,et al.Internalization of the receptor for advanced glycation end products(RAGE)is required to mediate intracellular responses〔J〕.J Biochem，2009;145(1):2130.

　　14 Origlia N，Righi M，Capsoni S.Receptor for advanced glycation end productdependent activation of p38 mitogenactivated protein kinase contributes to amyloidβmediated cortical synaptic dysfunction〔J〕.J Neurosci，2008;28(13)：352130.

　　15 Sheng TG，Jones RA，Zhou XQ,et al.Interkeukin1 promotion of MAPKp38 overexpression in experimental animals and in Alzheimer′s disease:potential significance for tau protein phosphorylation〔J〕. Neurochem Int，2001;39(56):341.

　　16 Wengenack TM，Curran GL，Poduslo JF.Targeting Alzheimer amyloid plaques in vivo〔J〕.Nat Biotech，2000;18：86872.

　　17 Monro OR,Mackic JB,Yamoola S,et al.Substitution at codon 22 reduces clearance of Alzheimer′s amyloidβ peptide from the cerebrospinal fluid and prevents its transport from the central nervous system into blood〔J〕.Neurobiol Aging，2002;23(3)：40512.

　　18 Mackic JB，Stins M，McComb JG,et al.Human bloodbrain barrier receptors for Alzheimer′s amyloidbeta 1 40.Asymmetrical binding，endocytosis，and transcytosis at the apical side of brain microvascular endothelial cell monolayer〔J〕.J Clin Invest，1998;102(7)：73443.

　　19 Deane R，Du Yan，Submamaryan RK,et al.RAGE mediates amyloid beta peptide transport across the blood brain barrier and accumulation in brain〔J〕.Nat Med，2003;9(9):90713.

　　20 Mattson MP.Apoptosis in neurodegenerative disorders〔J〕.Nat Pev Mol Cell Biol，2000;1(2)：120.

　　21 Lue LF，Walker DG，Brochova L,et al.Involvement of microglial receptor for advanced glycation endproducts(RAGE)in Alzheimer′s disease：identifcation of a cellular activation mechanism〔J〕.Exp Neurol，2001;171(1)：2945.

　　22 Yoshimaru T，Suzuki Y，Inoue T,et al.Extracellular superoxide released from mitochondria mediates mast cell death by advanced glycation end products〔J〕.Biochimica et Biophysica Acta，2008;1783(12):233243.

　　23 Arancio O，Zhang HP，Chen X.RAGE potentiates Aβinduced perturbation of neuronal function in transgenic mice〔J〕.EMBO，2004;23(20)：4096105.

　　24 Ghidoni R，Benussi L，Glionna M,et al.Decreased plasma levels of soluble receptor for advanced glycation end products in mild cognitive impairment〔J〕.J Neural Transm，2008;115(7):104750.

　　25 Sturchler E，Galichet A，Weibel M,et al.Sitespecific blockade of RAGEVd prevents amyloidβ oligomer neurotoxicity〔J〕.J Neurosci，2008;28(20)：514958.

　　26 Yan FL，Zheng Y，Zhao FD.Effects of ginkgo biloba extract EGb761 on expression of RAGE and LRP1 in cerebral microvascular endothelial cells under chronic hypoxia and hypoglycemia〔J〕.Acta Neuropathol，2008;116(5):52935.