血管紧张素Ⅳ对糖尿病大鼠胆碱乙酰转移酶表达及认知功能的影响

　　作者：张栋珉 肖谦 李娟 作者单位：重庆医科大学附属第一医院老年科内分泌组，重庆 400016

　　【摘要】目的 观察血管紧张素Ⅳ(AngⅣ)对糖尿病大鼠海马胆碱乙酰转移酶(ChAT)表达及认知功能的影响。方法 38只SD大鼠随机分为正常对照组、糖尿病组和糖尿病+AngⅣ组，建立STZ糖尿病大鼠模型， Morris水迷宫测试大鼠学习和记忆能力，免疫组化观察大鼠海马ChAT的表达，RTPCR检测ChAT mRNA水平的表达。结果 糖尿病+ AngⅣ组海马chAT及其mRNA表达与糖尿病组相比明显增高(P<0.05)，糖尿病+ AngⅣ组大鼠学习和记忆成绩也明显优于糖尿病组(P<0.05)。结论 AngⅣ对糖尿病大鼠认知功能有改善作用，其机制可能与ChAT表达增加有关。

　　【关键词】 血管紧张素Ⅳ;胆碱乙酰转移酶;认知功能

　　Effects of angiotensin Ⅳ on the expression of choline acetyltransferase and the cognitive function of diabetic rats

　　ZHANG DongMin, XIAO Qian，LI Juan.

　　Endocrinology Group, Department of Geriatrics, the First Affiliated Hospital, Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China

　　【Abstract】Objective To explore the effects of angiotensin Ⅳ on the expression of choline acetyltransferase (ChAT) and its mRNA in hippocampus and cognitive function of diabetic rats. Methods 38 SD male rats were divided into normal， diabetic model and angiotensin Ⅳ treatment groups randomly. Diabetes was induced by a single peritoneal injection of streptozotocin. 11 weeks later, learning and memory behaviors were investigated by a spatial version of Morris water maze test. The expression of ChAT of all rats was examined with immunohistochemical method and its mRNA expression was detected by RTPCR. Results Compared with diabetic model group, the changes of ChAT and its mRNA in hippocampus significantly increased in angiotensin Ⅳ treatment group(P<0.05). Meanwhile, learning and memory grade in angiotensin Ⅳ treatment group were better than those in diabetic model group(P<0.05). Conclusions Angiotensin Ⅳ could improve cognitive ability in diabetic rats by increasing the expression of ChAT and its mRNA levels.

　　【Key words】Angiotensin Ⅳ;Choline acetyltransferase;Cognition

　　有研究发现与认知功能有关的基底前脑、海马等处的胆碱能神经元在糖尿病认知功能障碍早期就存在明显退行性改变和代谢紊乱，ChAT表达减少〔1〕。胆碱乙酰转移酶(ChAT)是乙酰胆碱合成过程中最重要的酶，是决定生物体内乙酰胆碱含量的关键因素。国外有研究者报道血管紧张素Ⅳ(AngⅣ)对认知功能有着重要的影响，但AngⅣ对胆碱能神经递质表达以及糖尿病认知功能障碍的发病过程有无影响，目前尚未见报道。故本研究建立链脲佐菌素(STZ)糖尿病模型，运用Morris水迷宫测试其行为学改变，用免疫组化和RTPCR技术观察海马神经元ChAT及其mRNA表达变化，并用AngⅣ进行干预，进一步观察AngⅣ对糖尿病大鼠海马ChAT表达及其认知功能改变的影响，探讨糖尿病认知功能障碍可能的发病机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　STZ(美国Alexis公司);血糖仪(德国罗氏公司);大鼠脑立体定位仪(美国Stoelting公司);Morris水迷宫及水迷宫记录分析系统(中国医学科学院药物研究所研制);AngⅣ(购自美国凤凰药业有限公司);兔抗大鼠胆碱乙酰转移酶多克隆抗体(购自美国UCL公司);RTPCR试剂盒(购自美国TaKaRa公司);Trizol(上海生工生物工程技术服务有限公司);引物合成：赛百盛基因工程有限公司。

　　1.2 动物分组与处理

　　SD雄性大鼠38只，8～10周龄，体重180～220 g，购自重庆医科大学动物实验中心。动物适应喂养1 w后，随机分为正常对照组10只、糖尿病组14只和糖尿病+AngⅣ组14只。建立STZ糖尿病模型，大鼠禁食12 h，糖尿病组和糖尿病+AngⅣ组按60 mg/kg剂量腹腔一次注射1%STZ(溶于pH4.2，0.1 mol/L柠檬酸柠檬酸钠缓冲液)，正常对照组注射等量缓冲液。血糖稳定3 d后，尾静脉随机血糖>16.67 mmol/L认为糖尿病模型建立成功。成模后第11周，各组均进行水迷宫测试，之后糖尿病+AngⅣ组侧脑室每天注射AngⅣ5 nmol(1 nmol/μl)，糖尿病组和正常对照组注射等体积的生理盐水，持续1 w，所有实验大鼠再次进行水迷宫测试。实验终点糖尿病组大鼠死亡2只，糖尿病+AngⅣ组大鼠死亡3只。

　　1.3 Morris水迷宫测试

　　Morris水迷宫操作系统，包括直径150 cm的圆形水池，高15 cm、直径10 cm的平台，平台表面低于水面2 cm，水迷宫记录分析系统。糖尿病模型建模成功后第11周，训练3 d，第4天进行隐藏平台获得实验，分析潜伏期，考察学习能力。第5天撤去平台进行空间搜索实验去除平台观察2 min内大鼠在中心区域停留时间百分比以及通过原平台的次数，测试记忆能力。干预1 w再次重复上述实验。

　　1.4 AngⅣ干预

　　成模后第11周，各组大鼠水迷宫测试完毕即行AngⅣ干预。大鼠经4%水合氯醛(10 ml/kg)腹腔注射麻醉后，固定于脑立体定位仪，沿颅顶正中线剪开头皮暴露颅骨，大鼠侧脑室穿刺坐标〔2〕：前囟后1.0 mm，右1.5 mm，深3.5 mm。微型电钻沿此穿刺点钻孔。将带内芯的不锈钢套管(外径0.9 mm，内径0.5 mm)垂直插入侧脑室内，牙托粉黏合固定套管，凝固后缝合伤口。术后大鼠分笼饲养并予青霉素抗炎。导管置入后第4天开始进行侧脑室注射，生理盐水将AngⅣ配成所需浓度(1 nmol/μl)，微量注射器3 min内将5 μl AngⅣ溶液匀速注入侧脑室(AngⅣ组)，留针1 min，每天给药1次。正常对照组和糖尿病组注射等体积生理盐水，持续7 d。

　　1.5 免疫组化

　　采用SP法免疫组织化学染色。 处死大鼠，1%多聚甲醛心脏灌注取脑，石蜡包埋连续冠状切片，根据试剂盒说明检测ChAT在各组大鼠海马的表达。每只标本随机取1张切片，每张切片高倍镜(×400)下随机选择3 个视野的海马区域，采用ImagePro Plus6.0软件测定该区域ChAT阳性染色神经元的平均光密度值。

　　1.6 RTPCR法

　　大鼠断头，低温下快速取出海马组织，液氮冻存。称取50 mg海马组织，提取总RNA，进行RTPCR，ChAT引物序列为5'ACCTCGTCTGTGGAGTTTGCG3'，5' TCAAGATTGCTTGGCTTGGTT3'。条件：94℃预变性2 min;94℃30 s;57℃退火30 s;72℃延伸30 s，26个循环;72℃再延伸10 min;4℃保存。取PCR产物5 μl进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，照相记录。凝胶成像分析系统扫描RTPCR电泳结果，用Quantity One软件测定Volumn值，计算ChAT/βactin比值。

　　1.7 统计学处理

　　数据用x±s表示，均经过方差齐性检验和正态性检验，采用SPSS10.0统计分析软件进行方差分析。

　　2 结 果

　　2.1 隐藏平台获得实验

　　糖尿病组潜伏期增加，与正常对照组比较差异有显著性(P<0.05)。糖尿病+AngⅣ组较糖尿病组潜伏期明显缩短(P<0.05)，较正常对照组稍延长，但无统计学意义(P>0.05)，见表1。表1 大鼠空间搜索实验/隐蔽平台搜索实验结果(略)

　　2.2 空间搜索实验

　　糖尿病组与正常对照组相比，中心区停留时间百分比和通过原平台位置次数较明显下降(P<0.05)。上述参数，糖尿病+AngⅣ组较糖尿病组明显增加(P<0.05)，与正常对照组比较无明显差异(P>0.05)，见表2。

　　2.3 免疫组化结果

　　糖尿病组海马ChAT阳性神经元平均光密度明显降低，与正常对照组相比有显著性差异(P<0.05)。糖尿病+AngⅣ组与糖尿病组比较，上述指标明显增加(P<0.05)，但与正常对照组比较无明显差异(P>0.05)。见表2，图1。

　　2.4 ChAT mRNA的表达

　　糖尿病组ChAT mRNA表达水平明显下降(P<0.05)，经AngⅣ干预后可显著增加ChAT mRNA表达水平(P<0.05)，差异具有统计学意义。见表2，图2。表2 各组大鼠海马ChAT蛋白和mRNA表达结果(略)

　　3 讨 论

　　糖尿病认知功能障碍最早在上世纪20年代提出，随后很多学者也证实糖尿病患者确实存在明显的获得性的认知功能缺陷，这种认知缺陷在1型糖尿病和2型糖尿病都可以发生，主要表现为学习和记忆功能的减退。本实验采用STZ糖尿病模型，结果提示糖尿病大鼠在成模11 w出现学习能力减退;记忆能力也显著受损，与文献报道相一致〔3〕。本实验通过免疫组化和RTPCR方法检测糖尿病大鼠海马ChAT的表达，结果提示ChAT表达的显著降低导致糖尿病认知功能障碍发生。

　　血管紧张素Ⅳ(AngⅣ)是血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)C末端的6肽片段，由AngⅡ在氨基肽酶B的作用下裂解而成，AngⅣ在体内通过与其特异性的高亲和力受体AT4结合发挥作用。近年来有系列研究发现，AngⅣ不仅可以在被动回避反应实验中增强记忆和学习，而且可以预防由美加明、东莨菪碱、乙醇和缺血导致的记忆缺失〔4～6〕。本研究表明AngⅣ对糖尿病认知功能障碍有明显的改善作用。目前AngⅣ改善认知功能的机制仍不明确，推测其可能的途径有：①易化海马的长时程增强(LTP)效应;②A抑制海马神经元凋亡;③改善脑灌注〔7〕。而且我们的实验还发现在给予AngⅣ干预以后，糖尿病大鼠海马的ChAT的蛋白表达水平和mRNA表达水平都明显增加，与其Morris水迷宫成绩改善呈显著正相关，因此我们认为AngⅣ增加海马的ChAT表达水平，促进乙酰胆碱的合成，可能是其改善糖尿病认知功能障碍的又一重要途径，这为临床防治糖尿病认知功能障碍提供了新的思路。

　　然而，糖尿病认知功能障碍的发病机制极其复杂，RAS系统各成员与糖尿病认知功能的关系仍未完全阐明，继续深入的研究二者的关系将为糖尿病慢性并发症的防治提供坚实的实验基础，使更多的糖尿病患者受益。

　　【参考文献】

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　　7 Faure S，Chapot R，Tallet D.Cerebroprotective effect of angiotensin IV in experimental ischemic stroke in the rat mediated by AT(4) receptors〔J〕. J Physiol Pharmacol，2006;57(3):32942.