血管抑素对糖尿病肾病大鼠MMP2和MMP9表达的影响

　　作者：林红晓 李伟 作者单位：徐州医学院附属医院内分泌科，江苏 徐州 221002

　　【摘要】目的 探讨腺相关病毒介导血管抑素基因(rAAVAS)对糖尿病肾病(DN)大鼠肾皮质中基质金属蛋白酶2(MMP2)和9(MMP9)表达的影响。方法 采用链脲佐菌素(STZ)腹腔注射法建立糖尿病动物模型。SD大鼠随机分为对照组、糖尿病组、rAAV空载体组和rAAVAS治疗组。第10周检测大鼠的微量白蛋白尿(MAU)及肾脏肥大指数、肾功能、血糖、糖化血红蛋白;免疫组化观察肾皮质内MMP2、MMP9，光镜观察病理变化。结果 治疗组肾皮质中MMP2、MMP9的表达高于糖尿病组,但都低于对照组，免疫组化有相应的改变。结论 rAAVAS对DN大鼠肾脏具有保护作用,其可能机制与其上调大鼠肾皮质中MMP2、MMP9的表达，从而减少肾组织细胞外基质(ECM)的聚集有关。

　　【关键词】 腺相关病毒介导血管抑素基因;糖尿病肾病;基质金属蛋白酶2;基质金属蛋白酶9

　　糖尿病肾病(DN)本质上就是一种血管内皮紊乱综合征，是糖尿病最常见的慢性微血管并发症之一。肾小球细胞外基质的聚集继而硬化是DN特征性的病理改变〔1〕。肾组织中促使ECM降解的主要生理调节子是基质金属蛋白酶(MMPs)，即MMP2、MMP9，它可以降解已知的所有基质成分〔2，3〕。血管抑制素(AS)能够特异性抑制肿瘤血管内皮细胞增生的因子〔4〕，增加MMP表达，降低DN的蛋白尿〔5〕，发挥肾保护作用。 腺相关病毒介导血管抑素基因(rAAVAS)由于其宿主范围广，免疫原性低,表达携带基因长久等，被广泛用于基因治疗的实验研究 〔6，7〕。本实验旨在探讨rAAVAS对DN大鼠肾皮质中MMP2、MMP9表达的影响及其可能作用机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　雄性SD大鼠，体重160～180 g,8周龄，由徐州医学院动物中心提供。免疫组化试剂购于武汉博士德，链脲佐菌素(STZ)购自美国Sigma公司，rAAVAS由本元正阳公司构建。

　　1.2 方法

　　1.2.1 实验分组和模型制备

　　实验动物随机分为对照组(NC组,n=10);糖尿病肾病组(DN组,n=15);腺相关病毒空载体组(rAAV0组，n=15),AS组(rAAVAS，n=15，2×1012 μg/kg)，STZ 60 mg/kg)腹腔注射诱导糖尿病模型,72 h后尾静脉测血糖>16.7 mmol/L,诊断为糖尿病，并持续1 w以上，纳入实验。

　　1.2.2 标本收集

　　所有大鼠自由饮水，给予正常大鼠饲料,第10周末代谢笼收集24 h尿，保存于20℃冰箱，用于尿微量白蛋白(MAU)测定。称体重(BW)，后宰杀大鼠，右心房采血测血糖(BG)，糖化血红蛋白(HbA1c)、尿素氮(BUN)、血肌酐(Cr)。等渗盐水50 ml经腹主动脉灌注双肾，取肾，去肾包膜滤纸吸干血迹，称肾重(KW)，测肾指数(KI)(以KW/BW表示)。将部分左肾组织置于4%甲醛中固定待作光镜及免疫组化，右肾称重后立即放入液氮中保存。

　　1.2.3 检测方法

　　MAU采用放射免疫法检测，HbA1c采用高压液相色谱法检测，BG由罗氏血糖仪及试纸检测，UCr、SCr由OLYMPUS AU2700全自动生化分析仪检测，并计算内生肌酐清除率(Ccr)，结果用大鼠体重校正。

　　1.2.4 肾组织病理学观察

　　肾组织经10%中性甲醛固定,常规石蜡包埋,切片厚4 μm，HE染色，光镜下观察肾组织形态学改变。

　　1.2.5 免疫组化

　　采用二步法。4 μm厚石蜡切片常规脱蜡至水，微波加热修复，3%H2O2阻断内源性过氧化物酶后,分别滴加兔抗大鼠MMP2(1∶50)、MMP9(1∶50)多克隆抗体，4℃过夜。37℃复温后滴加二抗，37℃孵育30 min，DAB显色、苏木素复染、脱水、透明、封片。每张切片在高倍镜下(×200)随机采集10个视野,采用ImageProPlus 6.0图像分析软件测定每个视野中免疫组化阳性表达的积分光密度值(IOD)，然后计算平均值。

　　1.3 统计学处理

　　实验数据以x±s表示，采用SPSS 13.0统计软件，组间比较采用单因素方差分析。

　　2 结 果

　　2.1 动物一般情况观察

　　NC组大鼠毛发光泽，饮食正常，垫料5 d换一次;DN组及rAAV0组毛发枯黄，明显消瘦、多尿、多饮、早期多动，后期反应迟钝、动作迟慢、多汗、毛竖无光泽、小便量多，垫料1～2 d换一次; AS组饮食较DN组及rAAV0组明显改善，但不如正常组大鼠。表1 各组BW、KW、KI的变化(略)

　　2.2 rAAVAS对糖尿病大鼠BW的影响

　　DN组及rAAV0组较NC组KI增高(P< 0.05)，BW降低(P< 0.05);AS组与DN组及rAAV0组比较KI降低(P< 0.05)，BW升高(P<0.05)。DN组与rAAV0组KI比较差异无统计学意义(P> 0.05)，见表1。

　　2.3 rAAVAS对糖尿病大鼠BUN、Cr、24 h MAU、BG、HbA1c的影响

　　与NC组比较，DN组及rAAV0组BG、HbA1c、Cr、MAU明显升高(P<0.05)。AS组Cr、MAU、 BG、HbA1c较DN组及rAAV0组降低(P<0.05)，但DN组与rAAV0组间BG、HbA1c无统计学意义(P>0.05)，见表2。表2 各组BUN、Cr、24 h MAU、BG、HbA1c的变化(略)

　　2.4 免疫组化结果

　　NC组中MMP2、MMP9在肾小球及肾小管中均有微量表达,DN组及rAAV0组的表达则明显减弱(P<0.05),且主要在肾小管上皮细胞，而AS组的表达较DN组及rAAV0组增强(P<0.05)，见表3，图1。 表3 各组肾组织MMP2、MMP9IOD的比较(略)

　　3 讨 论

　　本实验结果表明，在DN大鼠中，MMP2、9表达明显减弱，致ECM降解减少及沉积，从而促进DN的病理进程。

　　AS最初是O′Reilly等于1994年从Lewis肺癌小鼠血清和尿液中分离出的能够特异性抑制肿瘤血管内皮细胞增生的因子〔2〕，它是血浆纤维蛋白溶酶原(Pgn)内部片段，可以通过弹性蛋白酶和(或)MMPs水解Pgn产生，能够有效地抑制与肿瘤生长、炎症相关的血管渗漏、增生。许多实验证实AS能够通过抑制病变血管通透性、保护血管内皮细胞、增加MMP表达等。抑制肿瘤生长〔8，9〕，抑制糖尿病视网膜病变〔10〕,降低DN的蛋白尿，血管抑素因其本身生物活性不够稳定，在体内代谢速度很快，因此无法在临床推广使用。重组AAV由于其宿主范围广，免疫原性低,表达携带基因长久等优点而越来越多地被用于基因治疗的实验研究。本研究选择腺相关病毒(AAV)作为基因转移的载体。发现 rAAVAS肌肉注射对DN具有较明显的效果，其可能机制主要通过增加MMP表达，促使ECM降解，延缓ECM在肾组织的积聚发挥肾脏保护作用。

　　本结果说明rAAVAS治疗能有效延缓DN发生发展，而且这种改善与血糖没有直接关系，rAAVAS对MMP2、MMP9表达的影响主要是AS的作用，而非腺相关病毒空载体的作用。

　　【参考文献】

　　1 Noh HJ，Kim HC，Lee SS，et al，The inhibitory effect of siRNAs on the high glucoseinduced overexpression of TGFβ1 in mesangial cells〔J〕. Korean Med Sci，2006;21:4305.

　　2 Nclennan SV,Ywe DK,Turthe JK.Effect of glucose on matrix metalloproteinase activity in mesangial cells〔J〕.Nephron,1998;79:2938.

　　3 Brownlee M.Advanced glycosylation in diabetes and aging〔J〕.Anna Kev Med,1995;46:22334.

　　4 O′Reilly MS,Holmgre L,Shiny Y，et al.Angiostatin:a novel angiogenesis inhibitor that mediates the suppression of metastases by a lewis lung carcinoma 〔J〕.Cell，1994;(79):31528.

　　5 Zhang SX,Wang JJ,Lu K,et al.Therapeutic potential of angiostatin in diabetic nephropathy〔J〕.J Am Soc Nephrol，2006;17(2):47586.

　　6 Xiao X,Li J,Samulski RJ.Production of hightiter recombinant adenoassociated virus vectors in the absence of helper adenovirus〔J〕.J Virol，1998;72(3):222432.

　　7 Isayeva T,Ren G,Ponnazhagan S.Intraperitoneal gene therapy by rAAV provides longterm survival against epithelial ovarian cancer independently of surviving pathway〔J〕.Gene Ther,2007;14(2):13846.

　　8 Schmitz V,Raskopf E,GonzalezCarmona MA,et al.Plasminogen derivatives encoding kringles 14 and kringles 15 exert indirect antiangiogenic and direct antitumoral effects in experimental lung cancer〔J〕.Cancer Invest，2008;25(5):4670.

　　9 Raisler BJ,Berns KI,Grant MB,et al.Adenoassociated virus type2 expression of pigmented epitheliumderived factor or Kringles 13 of angiostatin reduce retinal neovascularization〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A，2002;(99):890914.

　　10 Drixler TA,Kinfces IH,Kitchie ED,et al.Angiostatin inhibits pathology but not physiological retinal angiogenesis〔J〕.Invest Ophthalmol Vis Sci,2001;42:332530.