罗格列酮对高糖诱导大鼠血管平滑肌细胞炎症和增殖的影响

　　作者：赵占胜 王绵 梁江燕 谢赟 邓永贵 周红 王瑞英 张力辉 姚玉霞 丛斌 苏胜偶 作者单位：河北医科大学第二医院内分泌科，河北 石家庄 050000

　　【摘要】目的 探讨罗格列酮(RSG)对高浓度葡萄糖孵育下的血管平滑肌细胞(VSMCs)炎症和凋亡的影响及其可能的分子机制。方法 以不同浓度的葡萄糖和罗格列酮单独或联合孵育大鼠胸主动脉平滑肌细胞，ELISA方法检测培养基中单核细胞趋化蛋白1(MCP1)的水平;采用流式细胞术检测VSMCs细胞凋亡率及Bclxl、Bcl2蛋白表达;Western印迹检测胞浆中VSMCs Bclxl蛋白表达及NFκBp65和IκBα的表达。结果 高葡萄糖浓度(11.2、22.5 mmol/L)培养可明显增加上清中MCP1的浓度，促进VSMCs增殖，抑制其凋亡，上调Bclxl、Bcl2蛋白表达，同时使NFκB p65表达增加，IκBα表达下降;30及100 μmol/L RSG以浓度依赖形式减少VSMCs对MCP1的分泌，抑制高葡萄糖培养下(11.2、22.5 mmol/L)VSMCs Bclxl、Bcl2表达，促进其凋亡;下调NFκBp65表达，促进IκBα表达。RSG拮抗剂GW9662(10 μmol/L)预处理可部分拮抗RSG的作用。结论 RSG可能通过对NFκB通路的调控，减少炎症因子MCP1分泌，下调Bclxl、Bcl2表达，从而抑制高糖葡萄糖培养下的VSMCs炎症反应并促进其凋亡，从而在2型糖尿病大血管病变的防治中发挥重要作用。

　　【关键词】 罗格列酮;高葡萄糖;增殖;炎症;血管平滑肌细胞

　　Effects of rosiglitazone on inflammation and proliferation of rat vascular smooth muscle cells induced by high glucose

　　ZHAO ZhanSheng, WANG Mian, LIANG JiangYan, et al.

　　Department of Endocrinology, the Second Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050000, Hebei, China

　　【Abstract】 Objective To investigate the effects of rosiglitazone (RSG) on inflammation and apoptosis in rat vascular smooth muscle cells (VSMCs) induced by high glucose administration. Methods Rat VSMCs were incubated with glucose in different concentrations in the presence or absence of RSG or/and RSG antagonist GW9662. The concentration of MCP1 in the supernatant was measured with ELISA. The apoptotic rates and the protein expressions of Bclxl and Bcl2 were examined by flow cytometry. The Bclxl protein expression and NFκB p65, IκB protein expressions were also evaluated by Western blotting. Results High glucose(11.2, 22.5 mmol/L)significantly increased MCP1 secretion, inhibited apoptosis, upregulated Bclxl and Bcl2 expression in rat VSMCs. Meanwhile, NFκBp65 expression was increased and IκB protein expression decreased. RSG at 30, 100 μmol/L, in a concentrationdependent manner, significantly inhibited MCP1 secretion, promoted the cells to apoptosis and decreased expression of Bcl2, Bclxl protein induced by high glucose. Also NFκBp65 expression was downregulated accompanied with upregulation of IκB. The effects of RSG were partly attenuated after pretreated with RSG antagonist GW9662 (10 μmol/L). Conclusions Under high glucose concentration, RSG can reduce the proinflammatory mediator MCP1 secretion, downregulate the protein expressions of Bclxl and Bcl2 through modulating the NFκB pathway, subsequently inhibit the inflammatory and proliferative responses in VSMCs, which suggests that RSG may play a protective role against diabetic macroangiopathy.

　　【Key words】 Rosiglitazone; High glucose; Inflammation; Proliferation; Vascular smooth muscle cells

　　动脉粥样硬化(AS)是糖尿病(DM)大血管病变的主要病理基础。在高血糖、炎症因子等刺激下，血管平滑肌细胞(VSMCs)炎症激活、增殖过度和凋亡受阻等是AS发生的重要因素。过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARγ)可能通过抑制VSMCs炎症因子单核细胞趋化蛋白1(MCP1)的产生〔1〕和增生迁移，诱导其凋亡，对AS有直接的抑制作用〔2〕。目前国内外鲜有PPARγ对高浓度葡萄糖诱导下VSMCs对MCP1分泌和增殖、凋亡作用的相关报道。本研究旨在探讨人工合成的PPARγ高亲和性配体罗格列酮(RSG)对高浓度葡萄糖培养下VSMCs炎症和增殖、凋亡的影响及其可能信号转导机制，为RSG对DM患者AS预防作用提供理论依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 实验动物

　　雄性、健康Wistar大鼠体重(150±20) g，由河北医科大学动物实验中心提供。

　　1.1.2 主要试剂

　　DMEM低糖培养基购自Gibco公司;罗格列酮钠纯品由太极集团惠赠;αactin抗体、兔抗人βactin多克隆抗体、兔抗大鼠IκBα多克隆抗体、鼠抗NFκBp65单克隆抗体及化学发光试剂盒均购自美国Santa Cruz公司;GW9662购自瑞士ALEXIS公司;鼠单抗Bclxl抗体购自eBioscience公司;鼠单抗Bcl2抗体、辣根酶标记的山羊抗鼠IgG(H+L)购自北京中山生物技术有限公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 大鼠胸主动脉VSMCs的分离与培养

　　用10%水合氯醛麻醉大鼠 (0.4 mg/kg体重)，无菌条件下分离取出胸主动脉放入盛有无血清DMEM培养基的培养皿中，仔细剥去外膜结缔组织，再纵行剖开血管，刮去内膜层细胞，将血管段剪成约1 mm×1 mm大小的组织块，均匀种植于瓶底部，加入含20%胎牛血清的DMEM培养液2～3 ml，瓶底朝上静置于37℃、5% CO2培养箱中3～4 h，翻转培养瓶使组织块浸没于培养液中，半开放式绝对静置培养3 d，4～5 d时可首次换液。7～10 d时，组织块周围生长的细胞相互汇合，加入0.25%胰酶液消化，1∶2分装传代。采用免疫细胞化学鉴定αactin蛋白，确定为VSMCs。实验取5～6代细胞。

　　1.2.2 实验分组

　　对照组：NC，5.6 mmol/L葡萄糖;高糖一组：HG1，11.2 mmol/L葡萄糖;高糖二组：HG2，22.4 mmol/L葡萄糖;甘露醇高渗对照组：M，5.6 mol/L葡萄糖+16.8 mmol/L甘露醇;罗格列酮干预组：HG1+R100，11.2 mmol/L葡萄糖+100 μmol/L罗格列酮;HG2+R10，22.4 mmol/L葡萄糖+10 μmol/L罗格列酮(未行细胞凋亡率、Bcl、Bcl-XL检测);HG2+R30，22.4 mmol/L葡萄糖+30 μmol/L罗格列酮;HG2+R100，22.4 mmol/L葡萄糖+100 μmol/L罗格列酮;HG2+R100+GW9662，22.4 mmol/L葡萄糖+100 μmol/L罗格列酮+GW9662 (10 μmol/L)。

　　1.2.3 MCP1的检测

　　采用双抗体酶联免疫吸附试验 (ELISA)，试剂盒购于美国R&D公司，实验操作严格按照试剂盒操作步骤进行。检测仪器为芬兰产Wellscan.MK3型全自动酶联免疫检测仪，灵敏度为5 pg/ml。

　　1.2.4 流式细胞仪检测细胞凋亡率及Bcl2、Bclxl蛋白表达

　　取处于对数生长期的第5～6代细胞，无血清DMEM培养液孵育24 h使细胞同步，然后按预先的实验设计分组加药孵育 (均用无血清DMEM培养液)，GW9662提前3 h加入。48 h后用0.25%胰酶消化收集细胞 (每组细胞计数>1×106个)，3 000 r/min离心10 min，PBS洗涤并制成单细胞悬液，重复2次，4℃预冷乙醇 (终浓度为70%) 固定细胞，4℃冰箱保存。1 000 r/min离心4 min，弃固定液，冷PBS再洗2次，取单细胞悬液1×106/ml 0.1 ml加入碘化丙啶 (PI) 染液1 ml，4℃避光孵育30 min，以500目铜网过滤，使样品成为合格的单细胞悬液，用流式细胞仪检测细胞周期分布和凋亡率。取单细胞悬液1×106/ml 0.1 ml，加入鼠单克隆抗体Bcl2、鼠单克隆抗体Bclxl工作液0.1 ml，室温孵育30 min，加入PBS 10 ml洗涤一次，弃上清，加入羊抗鼠FITCIgG二抗，上机检测前加入PBS 0.1 ml经500目铜网过滤后上机检测。实验重复3次。

　　1.2.5 Western印迹法检测细胞NFκB p65和IκBα蛋白表达

　　取处于对数生长期的第5～6代细胞，无血清DMEM培养基孵育24 h使细胞同步。然后按实验设计分组加药 (GW9662提前0.5 h加入)0.5 h后收集细胞，提取细胞总蛋白，考马斯亮蓝定量。取200 μg胞浆蛋白，经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，100 V恒压转膜2.5 h。转膜完毕，丽春红染色，鉴定转膜效果。5%脱脂奶粉室温封闭1 h。分别加入1∶200鼠单抗NFκB、1∶150兔抗大鼠IκB抗体，4℃孵育过夜。加入1∶1 000辣根过氧化酶标记的山羊抗兔IgG，37℃孵育1 h。TBS溶液漂洗10 min×3次，暗室中进行化学发光，胶片爆光显影后分析结果。将显色条带扫描至计算机中，用ScionImage软件对结果进行半定量分析，用任意单位AU (Darea·Ddensity) 表示凝胶谱带的面积×荧光强度值。同时检测βactin的表达做为参照。以目的蛋白与的灰度比值表示蛋白表达水平。

　　1.3 统计学处理

　　数据用x±s表示，用SPSS14.0统计软件。各组均数的比较行单因素方差分析(ANOVA)，用最小显著差法(LSD) 作两两比较。

　　2 结 果

　　2.1 葡萄糖对VSMCs分泌MCP1的影响

　　11.2和22.4 mmol/L葡萄糖培养组上清液中MCP1浓度分别为(340.87±43.92) pg/ml和(664.87±23.07) pg/ml，较NC组(132.20±5.81) pg/ml有显著增加(P<0.01)。而M组〔(134.07±8.50) pg/ml〕与NC组相比差异无统计学意义(P>0.05)。与22.4 mmol/L葡萄糖单纯培养组比较，10、30和100 μmol/L RSG预孵育可使22.4 mmol/L葡萄糖诱导的MCP1浓度明显下降〔分别为(581.30±19.42)、(343.20±56.77)和(236.27±16.85) pg/ml，均P<0.01〕。应用GW9662预处理可部分拮抗RSG的作用(P<0.01)。

　　2.2 RSG对VSMCs凋亡的影响

　　11.2 mmol/L和22.4 mmol/L葡萄糖浓度依赖性地显著降低VSMCs的凋亡率，差异有统计学意义(P<0.05)，而M组对细胞凋亡率无影响(P>0.05);100 μmol/L RSG可明显降低11.2 mmol/L葡萄糖培养下VSMCs凋亡率(P<0.05);RSG (30、100 μmol/L) 明显增加22.5 mmol/L葡萄糖组的细胞凋亡率，差异有统计学意义(P<0.05)，呈浓度依赖性;GW9662能部分拮抗RSG的促凋亡作用，见表1。 表1 罗格列酮对高葡萄糖诱导的VSMCs凋亡率及Bcl2和Bclxl表达的影响(略)

　　2.3 RSG对Bcl2、Bclxl蛋白表达的影响

　　11.2和22.4 mmol/L葡萄糖浓度依赖性地显著增加VSMCs的Bcl2、Bclxl蛋白表达量，差异有统计学意义(P<0.05)，而M组对蛋白表达量无影响(P>0.05);100 μmol/L RSG可明显降低11.2 mmol/L葡萄糖培养下VSMCs Bcl2、Bclxl蛋白表达量，差异有统计学意义(P<0.05);RSG (30、100 μmol/L) 明显增加22.4 mmol/L葡萄糖培养下VSMCs Bcl2、Bclxl蛋白表达量，差异有统计学意义(P<0.05)，呈浓度依赖性;GW9662能部分拮抗RSG的上述作用，见表1。

　　2.4 葡萄糖及RSG对VSMCs NFκB p65和IκBα的影响

　　NC组与M组比较，NFκB p65和IκBα蛋白表达水平无统计学差异(P>0.05)。与NC组比较，11.2和22.4 mmol/L葡萄糖培养下NFκB p65表达显著增加，IκBα显著下降，差异有统计学意义(P<0.01)。而11.2和22.4 mmol/L葡萄糖培养下NFκB p65和IκBα水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2、图1。RSG以浓度依赖形式显著降低了22.4 mmol/L葡萄糖培养下NFκB p65表达量 (在30、100 μmol/L浓度下差异有统计学意义，P<0.01)，增加IκBα蛋白水平(P<0.01)。应用GW9662预处理后RSG的上述效应被明显抑制(P<0.01)，见表2、图1。表2 不同浓度RSG对高糖孵育的VSMCs

　　NFκB、IκBα蛋白水平的影响(略)

　　3 讨 论

　　大血管病变是DM患者严重的并发症之一，也是DM患者致残、致死的主要原因。慢性持续的高血糖是DM患者易发生AS主要原因之一。VSMCs做为血管壁的主要构成部分，在DM AS血管损伤的发病机制中占有重要地位。在正常血管壁，VSMCs处于静止状态，而当血管发生损伤后，VSMCs则成为具有增殖和分泌功能的细胞〔3〕。

　　MCP1属于趋化细胞因子家族中的CC亚家族成员之一，是一种重要的炎症趋化刺激因子，可由体内多种细胞产生，是胰岛素抵抗、2型糖尿病及其并发症发生、发展的危险因子。在高血糖等致病因素的刺激下，VSMCs可产生高水平的MCP1，吸引单核细胞黏附并浸润动脉壁，因此与动脉粥样硬化的发生关系密切。MCP1除能趋化单核细胞外，对VSMCs也有趋化、增殖的作用并促进组织因子生成，从而直接或间接地参与了动脉粥样硬化的形成。高浓度葡萄糖能浓度依赖性地促进人脐静脉内皮细胞MCP1 mRNA的表达和MCP1的分泌，诱导单核细胞向大血管内皮聚集，从而导致血管内皮系统功能的损害引起AS〔4〕。本研究结果表明，高浓度葡萄糖显著增加VSMCs对MCP1的分泌，且浓度越高，刺激效应越明显，与Dragomir等的研究相一致〔1〕，表明高糖状态下MCP1表达的上调可能导致了单核细胞和VSMCs的相互趋化，是糖尿病患者大血管病变中炎症反应的病理生理基础。

　　NFκB是一种具有多项转录调节作用的蛋白质，在静息时通常与抑制蛋白IκB结合，以无活性的形式存在于细胞质中。当细胞受到感染、照射等刺激后，IκB发生磷酸化降解，从而使NFκB活化，发生核移位，与靶基因结合，启动或调节早期反应基因的转录，参与炎症反应、细胞增殖和细胞凋亡。在2型糖尿病患者动脉粥样斑块及高葡萄糖培养VSMCs中均可检测到高水平的NFκB表达〔5〕。高浓度葡萄糖培养的VSMCs MCP1表达上调的机制为NFκB和AP1通路的激活，而MAPK抑制剂则可阻断IκB和cjun磷酸化〔1〕。本研究证实，随培养基中葡萄糖浓度的升高MCP1的表达增加的同时也伴随NFκB p65表达增加以及IκBα的表达减少，表明高糖可以诱导血管平滑肌细胞MCP1的表达增加，这种作用与NFκB/IκBα通路的激活有关。IκBα表达减少的原因可能由于其降解增加所致。

　　NFκB除了对炎症反应的调控作用外，还具有抗凋亡作用。Son等〔6〕报道蜂毒素可通过抑制NFκB和Akt活性，下调Bcl2等抗凋亡蛋白的表达，进而抑制VSMCs增殖并诱导其发生凋亡。凋亡调节紊乱在大血管病变的发病机制和进展中起着重要作用。有研究报道，高浓度葡萄糖培养可显著抑制大鼠主动脉VSMCs凋亡。这种与高葡萄糖相关的VSMCs对凋亡抵抗可能与抗凋亡基因Bcl2、Bclxl的过度表达有关〔7〕。我们的研究证实，高葡萄糖浓度依赖性地降低VSMCs凋亡率，NFκB表达上调，同时下调IκB的表达，同时抗凋亡蛋白Bcl2和Bclxl表达增加，说明高浓度葡萄糖可能通过NFκB通路，上调抗凋亡基因Bcl2和Bclxl表达，进而改变增殖和凋亡的相对平衡，使VSMCs凋亡受阻，这可能是糖尿病AS的重要病理生理机制之一。

　　PPARγ是核受体超家族PPARs成员，广泛表达于人和大鼠的VSMCs。噻唑烷二酮 (TZDs) 是PPARγ的人工合成配体激动剂，其中RSG已经作为胰岛素增敏剂广泛应用于临床。RSG可在培养的人脐静脉内皮细胞显著降低高半胱氨酸介导的NFκB活化，减少细胞间黏附分子1(ICAM1)和肿瘤坏死因子α(TNFα) 的表达〔8〕。本研究结果表明，随着培养基中RSG浓度的升高，培养上清中MCP1水平下降，细胞凋亡率显著上升，Bcl2、Bclxl表达下调，与此同时，胞浆中NFκB p65蛋白表达降低，IκBα的水平逐渐增加。若在加用RSG之前预先应用GW9662阻断PPARγ，则不同程度地抑制了上述效应，表明这种对VSMCs MCP1分泌的抑制作用和促凋亡效应是由于RSG的干预所引起，而且这种作用可能是通过NFκB通路实现的。

　　总之，RSG能通过抑制NFκB通路，明显抑制VSMCs对MCP1的分泌，下调抗凋亡蛋白的表达，促进高浓度葡萄糖诱导下的VSMCs发生凋亡，从而为RSG对T2DM心血管病变的保护作用提供了有力的理论依据。

　　【参考文献】

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　　2 Gizard F，Bruemmer D.Transcriptional control of vascular smooth muscle cell proliferation by peroxisome proliferatoractivated receptorgamma：therapeutic implications for cardiovascular diseases〔J〕.PPAR Res，2008：429123.

　　3 Ma KL，Ruan XZ，Powis SH,et al.Antiatherosclerotic effects of sirolimus on human vascular smooth muscle cells〔J〕.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2007;292(6)：H27218.

　　4 Takaishi H，Taniguchi T，Takahashi A,et al.High glucose accelerates MCP1 production via p38 MAPK in vascular endothelial cells〔J〕. Biochem Biophys Res Commun，2003;305(1)：1228.

　　5 Ramana KV，Friedrich B，Srivastava S,et al.Activation of nuclear factorkappaB by hyperglycemia in vascular smooth muscle cells is regulated by aldose reductase〔J〕.Diabetes，2004;53(11):291020.

　　6 Son DJ，Ha SJ，Song HS,et al.Melittin inhibits vascular smooth muscle cell proliferation through induction of apoptosis via suppression of nuclear factorkappaB and Akt activation and enhancement of apoptotic protein expression〔J〕.J Pharmacol Exp Ther，2006;317(2):62734.

　　7 Li H，Télémaque S，Miller RE,et al.High glucose inhibits apoptosis induced by serum deprivation in vascular smooth muscle cells via upregulation of Bcl2 and Bclxl〔J〕.Diabetes，2005;54(2):5405.

　　8 Bai YP，Liu YH，Chen J,et al.Rosiglitazone attenuates NFkappaBdependent ICAM1 and TNFalpha production caused by homocysteine via inhibiting ERK1/2/p38MAPK activation〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，2007;360(1):206.