PD1基因多态性与自身免疫性甲状腺病的相关性

　　作者：孙燕，朱江，朱本章，张怡，马卫国，何岚 作者单位：(西安交通大学医学院第一附属医院内分泌科，陕西西安 710061;陕西省第三人民医院胸外科，陕西西安 710061;西安医学院附属医院内分泌科，陕西西安 710073)

　　【摘要】 目的 探讨PD1基因多态性在西安地区汉族人中的分布及与自身免疫性甲状腺病(AITD)的关系。方法 应用PCRRFLP方法检测127例健康人、125例Graves病(GD)患者、117例桥本氏甲状腺炎(HT)患者PD1基因三个单核甘酸多态性位点PD1.1、PD1.3、PD1.5的基因型。结果 发现西安地区汉族人PD1.3位点不存在多态性;健康人、GD患者与HT患者PD1.1、PD1.5基因型、等位基因频率无显著性差异。结论 PD1.1、PD1.3和PD1.5基因型不能作为PD1基因与AITD相关的遗传标志。

　　【关键词】 PD1;自身免疫性甲状腺病;基因多态性

　　Association of PD1 gene polymorphism with autoimmune thyroid disease

　　Sun Yan, Zhu Jiang, Zhu Benzhang, Zhang Yi, Ma Weiguo, He Lan

　　(Department of Endocrinology, the First Affiliated Hospital, Medical School of　Xian Jiaotong University, Xian 710061; Department of Cardiosurgery, Third Shaanxi Provincial Peoples Hospital, Xian 710061; Department of Endocrinology,

　　the Affiliated Hospital of Xian Medical College, Xian 710073, China)

　　ABSTRACT: Objective To investigate the association of PD1 gene polymorphism with autoimmune thyroid disease (AITD) in Han Chinese in Xian. Methods Three singlenucleotide polymorphisms(SNP) PD1.1, PD1.3 and PD1.5 were genotyped by PCRRFLP in 127 healthy persons,125 Graves disease patients and 112 Hashimotos thyroiditis patients. Results PD1.3 was nonpolymorphism in Xian Han Chinese. There were no differences in distribution and frequency of PD1.1, PD1.5 genotypes and alleles between healthy persons and AITD patients. Conclusion Our result suggest that PD1 gene polymorphism is not associated with AITD.

　　KEY WORDS: PD1; autoimmune thyroid disease (AITD); gene polymorphism

　　Graves病、桥本氏甲状腺炎和特发性甲减被统称为自身免疫性甲状腺病(autoimmune thyroid disease, AITD)。这是一组由T细胞介导的器官特异性自身免疫病。T细胞活化需要识别双信号系统，即MHC抗原肽提供的第一信号和共刺激分子提供的协同刺激信号。共刺激分子中有正性和负性分子之分，二者之间的平衡对自身免疫的启动、发生、发展有重要意义。除CTLA4(cytotoxic T lymphocyte antigen4, CTLA4)外，PD1(programmed death1, PD1)为新近发现的负性共刺激分子，在多种自身免疫性疾病发生发展中起作用。目前，研究认为CTLA4基因是AITD的易感基因， PD1与CTLA4同属于CD28家族成员。那么，PD1基因是否也是AITD的易感基因? 关于PD1，Prokunina首次报道该基因SNP PD1.3 A/G与系统性红斑狼疮 (systemic lupus erythematosus，SLE)、类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis, RA)相关[1];Nielsen继之报道PD1.3与1型糖尿病相关[2];台湾地区发现PD1基因SNP PD1.5 C/T与RA相关[3];香港报告PD1基因SNP PD1.1 C/T与RA相关[4];但国内外文献均无PD1基因与AITD相关性的报道。本研究首次探讨PD1基因三个单核甘酸多态性位点PD1.1、PD1.3、PD1.5在中国人群中的分布及其与AITD的关系。

　　1 材料与方法

　　1.1 研究对象 对照组：127名西安地区汉族人，男性32人，女性95人，年龄(35.6±13)岁(12-69岁)，无甲状腺病及其他自身免疫病史，甲状腺功能测定正常。Graves患者组(GD组)：125 例GD患者，根据临床症状、体征、甲状腺功能测定，血清促甲状腺素受体抗体(TSH receptor antibodies，TRAb)阳性确诊为GD。男性36例，女性89例，年龄(34.9±11.8)岁(14-65岁)，无其他自身免疫病史。桥本氏甲状腺炎组(HT组)：112例HT患者，根据临床症状、体征、甲状腺功能测定、血清TPO抗体阳性和甲状腺穿刺活检确诊为HT。男性21，女性91例，年龄(34.2±12.1)(10-68)岁。无其他自身免疫病史。三组年龄、性别差异无统计学意义。

　　1.2 方法

　　1.2.1 基因组DNA的提取 静脉血200μL，EDTA抗凝。应用chelex100方法提取DNA,chelex100购自BioRad公司。

　　1.2.2 PD1.1基因分型 引物：上游5′GATCTGGAACTGTGGCCATGGT3′，下游5′CCCCCTCTGGGCTCAGGTT3′。PCR反应体系(20μL)：2×mix 10μL，两条引物浓度均为0.5μmol/L，模板200ng。PCR反应条件：95℃预变性5min进入循环，95℃变性15s，67℃退火15s，72℃延伸15s，共30个循环，最后72℃延伸10min。PCR产物长265bp，含mspⅠ酶切位点作为内对照。30g/L琼脂糖凝胶电泳确定基因型。AA基因型酶切产物显示180、85bp两条带;AG基因型酶切产物显示180、125、85、55bp四条带;GG基因型酶切产物显示125、85、55bp三条带。

　　1.2.3 PD1.3基因分型 引物：上游5′ TTTTCCTGCATGATCCACTG3′，下游5′TCTCCTGTCTCCAATGTAAG3′。 PCR反应体系(20μL)：2×mix 10μL，两条引物浓度均为0.5μmol/L，模板200ng。PCR反应条件：95℃预变性5min进入循环，95℃变性15s，57℃退火15s，72℃延伸25s，共35个循环，最后72℃延伸10min。PCR产物长386bp，含pstⅠ酶切位点作为内对照。60g/L聚丙烯酰胺凝胶电泳确定基因型。AA基因型酶切产物显示78、308bp两条带;AG基因型酶切产物显示78、98、210、308bp四条带，GG基因型酶切产物显示78、98、210bp三条带。

　　1.2.4 PD1.5基因分型 引物：上游5′AGACGGAGTATGCCACCATT3′，下游 5′CACTGTGGGCATTGAGACAT3′[5] 。PCR反应体系(20μL)：2×mix 10μL，两条引物浓度均为0.5μmol/L，模板200ng。PCR反应条件：95℃预变性3min进入循环，95℃变性15s，65℃退火15s，72℃延伸15s，共35个循环，最后72℃延伸10min。PCR产物长333bp。30g/L琼脂糖凝胶电泳确定基因型。CC基因型酶切产物显示333bp一条带;CT基因型酶切产物显示333、326、370bp三条带;TT基因型酶切产物显示263、370bp两条带。

　　1.3 统计学处理 采用SPSS11.0医用统计软件包对各组实验数据进行处理。采用χ2检验判断PD1.1、PD1.5基因型是否符合HardyWeinberg平衡定律。GD组、HT组、对照组间等位基因、基因型频率分布比较采用行列表χ2检验。

　　2 结果

　　2.1 PD1.3多态性分布 PD1.3A等位基因频率在对照组、GD组、HT组均<1%，可以认为PD1.3在中国人群中不存在多态性，不再进行疾病相关性分析。

　　2.2 PD1.1基因型与AITD的相关性 GD组、HT组、对照组间PD1.1基因型频率和等位基因频率无显著性差异(表1)。

　　表1 PD1.1基因型和等位基因频率在病例组和对照组中的分布(略)

　　Table 1 Frequency distribution of PD1.1 in case and control groups

　　Chisquare test: genotype frequency: GD vs. control χ2=2.29, P>0.05; HT vs. control χ2=0.33, P>0.05　allele frequency: GD vs. control χ2=0.007, P>0.05; HT vs. control χ2=0.11, P>0.05

　　2.3 PD1.5基因型与AITD的相关性 GD组、HT组、对照组间PD1.5基因型频率和等位基因频率无显著性差异(表2)。

　　2.4 PD1.1和PD1.5在西安地区汉族人中的分布 PD1.1和PD1.5在病例组与对照组间无显著性差异，合并统计两位点基因型、等位基因频率在西安地区汉族人中的分布(表3)。

　　2.5 PD1基因单核甘酸多态性等位基因频率在不同人群中的分布 西安地区汉族人PD1.3A、PD1.5C、PD1.1A等位基因频率与其他人种有明显差异(表4)，表内数字为各等位基因频率。

　　表2 PD1.5基因型和等位基因频率在病例组和对照组中的分布(略)

　　Table 2 Frequency distribution of PD1.5 in case and control groups

　　Chisquare test: genotype frequency: GD vs. control χ2=0.38, P>0.05; HT vs. control χ2=1.02, P>0.05;　allele frequency: GD vs. control χ2=0.37, P>0.05 HT vs. control χ2=0.10, P>0.05

　　表3 中国人群PD1.1、PD1.5基因型、等位基因的分布频率(略)

　　Table 3 Frequency distribution of PD1.1, PD1.5 in Xian han population

　　表4 PD1基因单核甘酸多态性等位基因频率在不同人群中的分布(略)

　　Table 4 Distribution of PD1 SNP allele frequency in different population

　　3 讨论

　　自身免疫性疾病的发生本质是自身反应淋巴细胞克隆得以发育并逃避自身耐受的调控。而T细胞耐受的丧失是这一过程的中心环节。近年的研究显示，共刺激分子在其中发挥了重要作用。共刺激分子有正、负之分，正性分子促进T细胞的启动、活化，而负性分子则抑制T细胞的启动、活化;正、负共刺激分子之间的平衡是调节自身免疫的启动、发生、发展的重要因素。正性分子过度表达或负性分子表达缺陷均可诱发T细胞耐受的丧失，而导致自身免疫发生。利用共刺激分子特别是负性分子进行免疫调节为免疫治疗提供了新思路。如利用CTLA4分子胞外段与人IgG 恒定区重组的融合蛋白CTLA4Ig，模拟CTLA4的作用，在动物实验中可减轻自身免疫病如类风湿关节炎、1型糖尿病、免疫相关性肾病的自身免疫反应。此外，CTLA4Ig还可诱导移植物免疫耐受。应用抗CTLA4的单克隆抗体可以阻断CTLA4作用，提高抗肿瘤免疫。但是，单纯利用CTLA4进行免疫调节并不十分理想，与其他共刺激分子或免疫调节因子联合作用可能发挥更理想的治疗效果。PD1是新发现的负性共刺激分子，利用PD1Ig或抗PD1的单抗在自身免疫病、器官移植、肿瘤的免疫治疗中发挥重要作用。对不同基因背景的PD1基因缺陷鼠的研究证实PD1在体内发挥负性免疫调节作用，对外周免疫耐受的维持发挥重要作用[6]。PD1基因敲除的C57BL/6鼠发生进行性肾小球肾炎及狼疮样关节炎，PD1基因敲除的BALB/c鼠发生扩张性心肌病，这种心肌病与自身免疫反应有关。PD1基因敲除的NOD鼠比普通NOD鼠更易发生1型糖尿病。人的PD1基因位于2q37.3，由5个外显子和4个内含子组成。全长9.6kb，其上游包含663bp的启动子。PD1基因主要有7个单核甘酸多态性位点。目前，对PD1基因与人类自身免疫病关系的报告，集中在PD1基因多态性与类风湿性关节炎，系统性红斑狼疮和1型糖尿病的关系。国外研究比较集中的是SNP PD1.3、PD1.1、PD1.5。研究显示，PD1.3(7146位点A/G)等位基因A与欧洲人RA、SLE、DM1的发生发展有关，PD1.5(8448位点C/T)等位基因A使中国台湾人RA的发病危险增加，PD1.1AA基因型使RA发病危险降低。而本实验的研究结果，即西安地区汉族人中PD1.3不存在多态性(最小等位基因频率<1%)，与香港的研究结果一致。本实验对PD1基因另外两个SNP位点PD1.1、PD1.5的研究发现，PD1.1、PD1.5基因型频率及等位基因频率在病例与对照组间无显著性差异。PD1基因多态性与AITD无关。西安地区汉族人PD1.1基因型和等位基因频率分布为AA 0.222，AG 0.524，GG 0.252，A 0.484，G 0.516。PD1.1基因型频率与欧洲人群有较大差异，欧洲人群中该位点不存在多态性。西安地区汉族人PD1.5基因型，等位基因频率分布为CC 0.519，CT 0.409，TT 0.072，C 0.723，T 0.277。PD1.5 C等位基因频率高于欧洲人。关于PD1.1、PD1.3、PD1.5基因多态性的作用机制，国外学者研究显示PD1.3位于PD1基因内含子4中，其内含有转录因子RUNX1的结合位点。PD1.3A/G和PD1.3A/A基因型的个体外周血中，单个核细胞的PD1mRNA表达低于PD1.3G/G基因型的个体。PD1.3A破坏了RUNX1的结合位点，减少了PD1的表达，影响自身免疫耐受的维持，诱发自身免疫反应[1]。SNP PD1.1的作用机制目前尚不清楚，可能与其位于启动子区，影响了PD1的表达有关。SNP PD1.5位于外显子5，PD1.5不同的基因型并不影响氨基酸的序列，但它可能通过与其他多态性位点连锁不平衡而影响PD1的表达。作为遗传标志，PD1.5在探讨PD1基因与疾病的关系方面具有重要意义。与国外的研究对比发现，中国人群PD1.1、PD1.3的基因型分布与欧洲人群有明显差别。这可能是不同人种遗传异质性的影响，并且可能与疾病谱相关。虽然我们的研究结果并未发现PD1基因与AITD相关，由于AITD的发生是遗传与环境因素共同作用的结果，除外环境因素的影响， PD1基因是否与AITD相关仍有待于对PD1基因进一步的研究。

　　基金项目：国家自然科学基金资助项目(No.30370678)

　　【参考文献】

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　　[3]Lin SC. Association of a programmed death 1 gene polymorphism with the development of the rheumatoid arthritis, but not systemic lupus erythematosus [J]. Arthritis rheumatism, 2004, 50(3):770775.

　　[4]Kong EK, ProkuninaOlsson L, Wong WH, et al. A new haplotype of PDCD1 is associated with rheumatoid arthritis in Hong Kong Chinese [J]. Arthritis Rheumatism, 2005, 52(4):10581062.

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