T细胞CTLA-4、TCRVβ8基因克隆、重组及表达

　　作者：王晶，朱江，朱本章，马卫国 作者单位：西安交通大学医学院第一附属医院内分泌科，陕西西安 710061

　　【摘要】 目的 克隆Graves’病患者甲状腺组织T淋巴细胞的CTLA-4胞外段和TCRVβ8目的基因，重组为CTLA-4-TCRVβ8基因并表达出融合蛋白。方法 RT-PCR从Graves’病患者甲状腺组织中克隆T淋巴细胞的CTLA-4胞外段和TCRVβ8基因，依次与表达质粒进行连接，双酶切及测序鉴定获得正确的重组子;原核表达融合蛋白，SDS-PAGE及Western-Blotting检测蛋白表达情况。结果 基因克隆扩增出CTLA-4和TCRVβ8目的基因片段，测序结果证实序列与已发表的一致。重组基因原核表达出与预期分子质量大小相符的目的蛋白。结论 成功构建和表达了CTLA-4-TCRVβ8基因，为探索Graves’病免疫耐受治疗提供了基因产品

　　【关键词】 Graves’病;CTLA-4;TCRVβ;基因表达;融合蛋白

　　Gene clone, recombination and expression of CTLA-4,TCRVβ8 of human T lymphocyte

　　Wang Jing, Zhu Jiang, Zhu Benzhang, Ma Weiguo

　　1. Department of Endocrinology, the First Affiliated Hospital, Medical School of

　　Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710061;

　　2. the Third People’s Hospital, Xi’an 710061;

　　3. the Affiliated Hospital of Xi’an Medical College, Xi’an 710077, China

　　ABSTRACT: Objective To clone CTLA-4 and TCRVβ8 gene from T lymphocyte of thyroid of Graves’ disease (GD) patients, recombine to form CTLA-4-TCRVβ8 fusion gene and express the fusion protein. Methods CTLA-4 and TCRVβ8 gene was cloned from T lymphocyte of thyroid of GD patients by RT-PCR. Then it was recombined with expression plasmid in order. The correct plasmids were obtained after the restriction analysis and DNA sequencing. Prokaryotic expression of the fusion protein in E.coli, SDS-PAGE and Western Blotting were used to verify the fusion protein. Results Restriction analysis and DNA sequencing confirmed the correct sequence and insertion site of the recombinant plasmid. The recombinant fusion protein was successfully expressed in E.coli, which was consistent with the predicted putative calculating molecular weight. Conclusion CTLA-4-TCRVβ8 gene was constructed and expressed successfully, providing gene product and application theory for immune tolerance therapy of GD.

　　KEY WORDS: Graves’ disease(GD); CTLA-4; TCRVβ8; gene expression; fusion protein

　　Graves’病(Graves’ disease, GD)是一种器官特异性自身免疫性疾病，是甲状腺功能亢进症中最常见的类型。自身免疫病的T细胞活化需要双信号刺激，阻断第一信号则特异性免疫应答不能发生，阻断协同刺激信号，T细胞则进入无反应状态或发生凋亡。细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)是下调或终止T细胞反应的重要协同刺激分子[1]，CTLA-4Ig能有效阻断免疫反应，诱导免疫耐受，但缺乏特异性[2]。研究发现Graves’病患者甲状腺组织浸润T淋巴细胞为寡克隆性[3]，存在某些TCRVβ或TCRVα[4]基因家族亚型基因的优势利用现象，其中TCRVβ8为TCRVβ优势利用基因之一[5]。基因重组、表达CTLA-4-TCRVβ8融合蛋白，既利用TCRVβ8优势基因产物阻断TCR对特异性抗原的识别，又利用CTLA-4阻断协同刺激信号，以达到同时阻断T细胞激活依赖的双信号作用，从而抑制或避免甲状腺特异性T细胞活化，来解决或部分解决CTLA-4诱导免疫耐受的特异性问题。本实验构建了pcDNA3.1(+)-CTLA-4-TCRVβ8质粒，并在大肠杆菌中诱导其表达，初步验证了融合蛋白的生物活性。

　　1 材料与方法

　　1.1 主要试剂

　　pcDNA3.1(+)、pET28a(+)质粒由本校免疫病理教研室提供，Trizol购自Invitrogen公司，反转录试剂盒购自MBI公司，Taq酶购自Stratagene公司，dNTP购自Toyobo公司，各种限制性内切酶、T4 DNA连接酶购自TaKaRa公司，PCR引物由上海生工公司合成，质粒提取试剂盒购自Omega公司，胶回收试剂盒购自U-gene公司，小鼠Anti-His Antibody、HRP-羊抗鼠IgG多克隆抗体购自华美生物工程公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 RNA提取和cDNA合成

　　用Trizol法提取Graves’病患者甲状腺组织T淋巴细胞mRNA。按MBI逆转录试剂盒说明书逆转录反应获取cDNA。

　　1.2.2 PCR扩增CTLA-4的基因片段

　　根据GenBank中CTLA-4胞外段的基因序列(基因文库号：L15006)设计引物。上游：5′-CTGGATCCGCCGCCACATGGCTTGCCTTGGATTTC-3′;下游：5′-CAGAATTCAGAATCTGGGCACGGTTC-3′，含BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点，同时上游引物5′端加入Kozak序列。PCR反应按本室常规方法进行，PCR产物用15 g/L琼脂糖凝胶电泳检测。

　　1.2.3 重组质粒pcDNA3.1(+)-CTLA-4的构建CTLA-4基因片段和pcDNA3.1(+)质粒经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后，回收酶切片断。用T4 DNA连接酶连接。连接产物转化E.coli DH5α，提取质粒，进行双酶切及测序鉴定获得正确重组质粒。

　　1.2.4 PCR扩增TCRVβ8的基因片段

　　根据GenBank中TCRVβ8的基因序列(基因文库号：X00437)设计引物。上游：5′-CTGAATTCATGGACTCCTGGACCTT-3′;

　　下游：5′-CACTCGAGCTACTCACTCACGGGCTGCTCCTTGAGGGGCTGCG-3′，含EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点，同时下游引物5'端加入能适应三种不同读码框架的终止密码子。PCR反应按本室常规方法进行，产物用15 g/L琼脂糖凝胶电泳检测。

　　1.2.5 重组质粒pcDNA3.1(+)-CTLA-4-TCRVβ8的构建

　　TCRVβ8基因片断和pcDNA 3.1(+)-CTLA-4质粒经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后，回收酶切片段。用T4 DNA连接酶连接。连接产物转化E.coli DH5α，提取质粒，进行双酶切及测序鉴定获得正确重组质粒pcDNA3.1(+)-CTLA-4-TCRVβ8。

　　1.2.6 PCR扩增CTLA-4-TCRVβ8目的基因片段

　　从正确的重组子pcDNA3.1(+)-CTLA-4-TCRVβ8上扩增。上游引物：5′-CTGGATCCATGGCTTGCCTTGGATTTC-3′;下游引物：5′-CACTCGAGGGGCTGCTCCTTGAGGGGCTGCG-3′，含BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点。PCR产物用12 g/L琼脂糖凝胶电泳检测。

　　1.2.7 重组质粒pET28a(+)-CTLA-4-TCRVβ8的构建

　　CTLA-4-TCRVβ8目的基因片段和pET28a(+)质粒经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后，回收酶切片段。用T4 DNA连接酶连接。连接产物转化E.coli DH5α，提取质粒，双酶切及测序鉴定获得正确重组子。

　　1.2.8 融合蛋白的原核表达

　　将测序获得的正确重组子转化BL21(DE3)株。异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度1mmol/L，诱导表达4 h，离心收集菌体。100 g/L SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测蛋白表达情况。

　　1.2.9 Western-Blotting检测

　　将少量已诱导的工程菌行SDS-PAGE电泳，然后在冰浴条件下将蛋白转印至硝酸纤维膜上，小鼠Anti-His Antibody为一抗，HRP-羊抗鼠IgG多克隆抗体为二抗，DAB显色检测目的蛋白并扫描记录实验结果。

　　2 结果

　　2.1 CTLA-4基因片段的获得

　　与预期结果相符合的504 bp条带(图1)。

　　2.2 重组质粒pcDNA3.1(+)-CTLA-4的双酶切鉴定

　　经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后，可得到5.4 kb和504 bp两个片段，证实为CTLA-4插入pcDNA3.1(+)(图2)。

　　2.3 序列分析

　　经测序证实，质粒pcDNA3.1(+)-CTLA-4中CTLA-4基因序列与文献[6]报道的CTLA-4胞外区cDNA序列一致，无碱基突变、缺失和移码突变，且外显子1第49位基因多态性位点为G[7]。

　　2.4 TCRVβ8基因片断的获得

　　与预期结果相符的628bp条带(图3)。

　　2.5 重组质粒pcDNA3.1(+)-CTLA-4-TCRVβ8的双酶切鉴定

　　经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切，可得到5.9 kb和628 bp两个片段，经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后，可得到6.0 kb和504 bp两个片段。证实为TCRVβ8插入pcDNA3.1(+)-CTLA-4(图4)。

　　2.6 序列分析

　　经测序证实，重组子pcDNA3.1(+)-CTLA-4-TCRVβ8中CTLA-4基因序列未见碱基突变、缺失和移码突变，TCRVβ8基因序列与文献[8]相符，通过基因文库同源比较证实属于TCRVβ8亚家族。

　　序列中的黑体背景字为酶切位点BamHⅠ、EcoRⅠ和XhoⅠ，粗体字为Kozak和终止密码。

　　2.7 CTLA-4-TCRVβ8基因片段的获得

　　从正确的重组子pcDNA3.1(+)-CTLA-4-TCRVβ8上经PCR扩增出与预期结果相符的1 098 bp目的条带(图5)。

　　2.8 重组质粒pET28a(+)-CTLA-4-TCRVβ8的双酶切鉴定

　　经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切，可得到5 kb和1 098 bp两个片段，证实为CTLA-4-TCRVβ8插入pET28a (+)中(图6)。

　　2.9 序列分析

　　经测序证实，重组子pET28a(+)-CTLA-4-TCRVβ8基因序列与预期相符，无碱基突变、缺失及移码突变。

　　2.10 CTLA-4-TCRVβ8融合蛋白的原核表达

　　2.10.1 SDS-PAGE电泳结果

　　在分子质量为43 ku处有一条明亮带，与预期相符(图7)。

　　3 讨论

　　为了使融合蛋白能够高效表达，本实验在起始密码子上游插入了一个内含子Kozak序列。在CTLA-4和TCRVβ8两段基因的连接顺序上，由于CTLA-4的基因序列恒定不变，TCRVβ在结构上分为恒定区(C区)和可变区(V区)两部分，V区中尤其是高变区中的CDR3具有更高的高变程度，是独特性抗原主要所在的部位。因此，将CTLA-4胞外段的基因序列放在前面，以便设计后面共同的酶切位点并确保两段基因的阅读框架。

　　采用PCR、双酶切及测序的方法证实成功构建出重组基因CTLA-4-TCRVβ8。为进一步明确其是否能表达出完整的蛋白质，测定表达产物及其生物活性，利用大肠杆菌表达方便、快速以及表达量高的特点，同时pET载体His-Tag序列便于蛋白的检测[9]，我们将重组基因CTLA-4-TCRVβ8克隆进入pET28a(+)表达载体，转化大肠杆菌进行表达，以此初步验证CTLA-4-TCRVβ8融合蛋白的生物活性，为下一步将CTLA-4-TCRVβ8重组基因在真核系统中表达及大规模生产提供了基因产品和生产产品的方法。

　　由于时间的限制，关于CTLA-4-TCRVβ8融合蛋白诱导免疫耐受的有效性和特异性问题并未得到证实。TCRVβ8仅为Graves’病患者甲状腺组织浸润T淋巴细胞优势利用基因之一，尚需分别构建其他优势利用基因的表达载体及测定表达产物及其生物活性，依此为Graves’病的免疫耐受治疗新途径提供较为完善的理论依据，最终实现从免疫学异常的启动环节上对甲亢进行治疗，这些工作仍需进一步探索。

　　【参考文献】

　　[1]门敏，朱本章. 协同刺激分子与自身免疫性甲状腺病 [J]. 国外医学内分泌学分册, 2005, 25(3):207-209.

　　[2]Cabrian KM, Berry KK, Shuford WW, et al. Suppression of T-cell-dependent immune responses in monkeys by CTLA-4Ig [J]. Transplant Proc, 1996, 28(6):3261-3262.

　　[3]Martin A, Matsuoka N, Zhang J, et al. Preservation of function human thyroid "organoid" in the scid mouse. Ⅳ. In vivo selection of an intrathyroidal T cell receptor repertoire [J]. Endocrinology, 1997, 138(11):4868-4869.

　　[4]门敏，朱江，朱本章，等. Graves’病甲状腺组织中T细胞受体Vα基因限制性取用现象的研究 [J].中华内分泌代谢杂志, 2007, 23(3):254-256.

　　[5]张进安，王一理，朱本章，等. T细胞受体Vβ基因在自身免疫性甲状腺病变组织中的表达及意义 [J]. 中华病理学杂志, 2001, 30(4):268-272.

　　[6]Linsley PS, Brady W, Urnes M, et al. CTLA-4 is a second receptor for the B cell activation antigen B7 [J]. J Exp Med, 1991, 174(3):561-569.

　　[7]Kouki T, Sawai Y, Gardine CA, et al. CTLA-4 gene polymorphism at position 49 in exon 1 reduces the inhibitory function of CTLA-4 and contributes to the pathogenesis of Graves’ disease [J]. J Immunol, 2000, 165:6606-6611.

　　[8]Duby AD, Seidman JG. Abnormal recombination products results from aberrant DNA rearrangement of the human T-cell antigen receptor chain gene [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1986, 83:4890-4894.

　　[9]Sato N, Nakayama M, Arai K, et al. Fluctuation of chromatin unfolding associated with variation in the level of gene expression [J]. Gene Cells, 2004, 9(7):619-630.