小鼠Reg3α基因cDNA成功转染MIN6细胞株并促其生长

　　作者：崔巍，黄葶，施秉银，LIU Junli 作者单位：1. 西安交通大学医学院第一附属医院内分泌代谢科，陕西西安 710061;2. Department of Medicine, McGill University Health Centre, Montreal H3A1A1, Canada

　　【摘要】 目的 建立一过表达Reg3α cDNA的胰岛MIN6细胞株，研究其在低葡萄糖环境中的生长特性。方法 将全长Reg3α cDNA插入到质粒载体pcDNA3.1中，并将Reg3αpcDNA3.1和pcDNA3.1空载体用脂质体法转染胰岛MIN6细胞，分别获得Reg3α cDNA过表达和空载体pcDNA3.1MIN6细胞。应用Realtime PCR和Western blot方法检测这两种细胞在低葡萄糖培养基中Reg3α的表达，并用MTT法测定Reg3α过表达对MIN6细胞生长的影响。结果 有三株Reg3α转染的细胞株显示Reg3α的高表达，在空载体转染的MIN6细胞株中未检测到Reg3α的表达，Reg3α mRNA和蛋白水平分别平均升高6～10倍。用Western blot检测发现Reg3α蛋白释放到培养液。采用MTT法测定，与空载体转染的MIN6细胞株相比，三株Reg3α稳定转染细胞株，7d后细胞数目升高2倍。结论 本研究结果表明已成功地建立了过表达Reg3α cDNA的胰岛MIN6细胞。Reg3α可能具有内分泌作用，促进胰岛细胞生长。

　　【关键词】 MIN6细胞株;胰岛;Reg基因;转染;生长

　　cell viability by Reg3α cDNACUI Wei1, HUANG Ting1, SHI Bingyin1, LIU Junli2

　　(1. Department of Endocrinology and Metabolism, the First Affiliated Hospital,

　　Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710061, China;

　　2. Department of Medicine, McGill University Health Centre, Montreal H3A1A1, Canada)ABSTRACT: Objective To create a MIN6 cell line overexpressing murine Reg3α cDNA and to investigate its cell viability character under low glucose concentrations. Methods The fulllength murine Reg3α cDNA was inserted into the plasmid pcDNA3.1(). Then MIN6 cells were transfected with the Reg3αpcDNA3.1 and pcDNA3.1 vector alone to establish Reg3αoverexpression and empty vector MIN6 cell line. Reg3α protein in the low glucose concentration cell medium was detected by Western blot. Cell viability was evaluated by an MTT reduction conversion assay. Results Three Reg3αoverexpression MIN6 cells were confirmed by realtime PCR and Western blot. Reg3α expression was barely detectable in the cells transfected with the empty vector alone. In contrast, the levels of Reg3α mRNA and protein in three pcDNAReg3αtransfected clones were increased by an average 10 and 6fold, respectively. Western blot also revealed Reg3α protein release into the culture medium. In MTT cell proliferation assay, compared to vectortransfection alone, three clones of Reg3αoverexpression MIN6 cells exhibited 2fold increases in cell number over 7 days when cultured in the presence of 10mL/L fetal bovine serum and 5.5mmol/L glucose. Conclusion The Reg3αoverexpression MIN6 cells have been established. Reg3α protein was detectable in culture medium, supporting an endocrine action, and Reg3α overexpression promoted islet cell growth.

　　KEY WORDS: pancreatic islet; Reg3α gene; transfection; MIN6 cell line

　　1988年，TERAZONO等[1]发现对胰腺切除90%的大鼠喂饲多聚(ADP核糖)聚合酶抑制剂—尼克酰胺后可以促进胰岛的新生。从新生胰岛cDNA文库中分离得到Reg基因(regenerationassociated gene)，可翻译一种刺激胰岛β细胞生长的分泌蛋白，改善切除90%胰腺的糖尿病鼠及非肥胖糖尿病(NOD)鼠的疾病状态。1997年命名为RegⅠ基因。我们根据检索GenBank及查阅Pubmed相关文献，确定已有18个Reg基因家族成员被克隆和鉴定[2]。根据蛋白质的序列特征，人类和鼠的Reg家族蛋白应属于C型凝集素超家族。尽管Reg基因家族从碱基与氨基酸序列具有高度同源性，并且都具有单个C型凝集素糖基识别区，但各自又具有不同的结构特点[3]。已有研究发现：RegⅠ和INGAP(islet neogenesis associated protein)可以在体外或体内促进β细胞新生，减少β细胞凋亡[45]。然而其他新的Reg基因功能尚未阐明。为了进一步明确过度表达的Reg3α在体外对胰岛β细胞生长的影响，本实验将Reg3αpcDNA3.1和pcDNA3.1空载体分别转染到MIN6细胞中以建立过表达Reg3α cDNA的胰岛MIN6细胞株和空载体pcDNA3.1MIN6细胞株(以下简称MIN6/Reg3α细胞和MIN6/pcDNA3.1)，用于Reg3α基因的功能研究。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 MIN6β细胞株由加拿大McGill大学刘均利教授提供。pBSReg3α cDNA由日本奈良医科大学的SHIN TAKASAWA博士提供。pcDNA3.1、DMEM培养基、胎牛血清(GIBCO)、AntibioticAntimycotic(100×)购自Invitrogen 公司。QuantiFast SYBR Green RTPCR一步法试剂盒及QuantiTect Reg3α引物购自加拿大QIAGEN公司，G418自Gibco BRL公司购买。ECL高级Western blot检测试剂盒购自Amersham公司，抗小鼠Reg3α单克隆抗体购自R&D Systems公司，抗小鼠βActin单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，其余化学试剂均购自美国Sigma公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 DNA载体构建 全长Reg3α cDNA(GenBank access number NM_011259)自质粒载体Bluescript中的EcoRⅠ和KpnⅠ位点中酶切后插入到质粒载体pcDNA3.1中，该载体含有巨细胞病毒(CMV)调节区及可选择性标记neo。EcoRⅠ、KpnⅠ双酶切BluescriptReg3α和pcDNA3.1载体，经琼脂糖电泳后回收目的条带，通过电泳估计回收后二者的量，然后按照载体∶片段为1∶7混合，使用T4 DNA连接酶于16℃过夜，将目标片段与载体连接，最后取25μL连接产物转化100μL感受态DH5α，涂布于100mg/L氨苄青霉素LB琼脂平板上。于37℃孵育14h后，平板上长出15个克隆，将这些克隆接种至含100mg/L氨苄青霉素的LB培养基，置37℃以260r/min震摇14h后取菌液，选取5个克隆菌液提取质粒，作PCR并以EcoRV和HindⅢ、XhoⅠ和HindⅢ双酶切验证目标片段的存在。选取一个克隆送McGill大学基因检测中心测序。测序结果证明Reg3α基因已经插入到pcDNA3.1载体，未出现点突变和读码框移。

　　1.2.2 稳定细胞株的培养及转染筛选 当培养于T75培养瓶中的MIN6β细胞(18～20代)80%汇合时，用含1g/L ETDA的1g/L胰酶消化并吹散，分种12孔板中，每孔0.5×106个细胞，置于100mL/L胎牛血清、5.6mmol/L葡萄糖、10mL/L AntibioticAntimycotic、0.005mL/Lβ巯基乙醇DMEM培养液中37℃、50mL/L CO2培养箱内培养24h。

　　利用Transfectamine 2000转染pcDNA3.1Reg3α和载体pcDNA3.1，转染后的MIN6细胞置于含5×10-4g/L G418培养液内4周，挑出存活细胞(标记为第4代)，转移到含2×10-4g/L G418的T25培养瓶继续培养。采用Real time PCR和Westen blot方法检测第7～8代稳定转染MIN6细胞Reg3α的表达，筛选出过表达Reg3α cDNA的胰岛MIN6细胞株。

　　1.2.3 Reg3α mRNA的分析 用硫氰酸胍方法将总RNA从转染的MIN6细胞中提取。RNA浓度由ND1000分光光度计(NanoDrop)测定。以βactin mRNA作为内参照，每个样品采用5ng总RNA与Reg3α引物(QT00093534)，按照QIAGEN的QuantiFast SYBR Green RTPCR 一步法说明，上Lightcycler实时荧光定量PCR仪(德国罗氏公司)，在mRNA水平上检测Reg3α的表达。

　　1.2.4 蛋白的分析 采用蛋白裂解液(150mmol/L NaCl, 10mmol/L Tris，pH 7.4，1mmol/L EDTA，1mmol/L EGTA, 100g/L Triton X100，5mL/L Nonidet P40，100mmol/L NaF，10mmol/L sodium pyrophosphate，10mmol/L sodium orthovanadate，蛋白酶抑制剂Roche Applied Science)在4℃提取细胞蛋白。用Brad法蛋白定量，50μg蛋白被130g/L聚丙烯酰胺、1g/L SDS胶分离，再转移到醋酸纤维素膜，转印膜用含50g/L脱脂奶粉的TBST室温封闭1h，然后加入抗Reg3α抗体(用封闭液1∶500稀释)4℃冷室中过夜。用TBST洗膜3次，每次10min，再加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG(用封闭液1∶5000稀释)，室温孵育1h。用TBST洗膜3次，每次10min。用增敏化学发光底物试剂检测。以MIN6/Reg3α及MIN6/ pcDNA3.1细胞的βActin表达作为内参照，分别检测细胞及其培养基的Reg3α的表达。

　　1.2.5 Reg3α稳定转染细胞增殖测定 采用MTT(molecular probeinvitrogen)测定。Reg3α和载体pcDNA3.1稳定转染的细胞种在96孔板，8000个/孔，待细胞85%贴壁，换成5mg/L BSA无血清培养液细胞同步化培养36h，弃去原有培养基，换用10mL/L的胎牛血清和5.6mmol/L的葡萄糖培养液培养，分别在第1、3、5、7、9天MTT测定细胞增殖率。每组10个复孔，每孔总反应体系为200μL。分别在上述设定的时间点，用倒置显微镜观察细胞，然后每孔加入MTT 10μL，继续培养4h。弃去上清液，每孔加入二甲基亚砜150μL，振荡10min，酶标仪(德国BGM公司，型号：POLARstarOPTIMA)测定540nm下各个组实验对象的吸光度。实验重复3次，对结果进行统计学分析。

　　1.2.6 统计学处理 所有实验数据以均数±标准差表示。由SPSS10.0统计分析软件处理。采用单因素方差分析进行组间比较，两组比较采用成组设计资料t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 Reg3α稳定转染MIN6细胞的鉴定和筛选 载体pcDNA3.1及pcDNA3.1Reg3α转染的MIN6细胞经G418的选择，分别挑出MIN6/pcDNA3.1细胞3株vector(6、8、9)和MIN6/Reg3α细胞6株reg3α(1、2、3、4、5、6)。采用Realtime PCR和Western blot方法检测第7～8代稳定转染MIN6细胞Reg3α和βactin的表达，筛选出所需细胞系。在mRNA表达水平和蛋白表达水平上，仅MIN6/pcDNA3.1细胞vector 6、8、9几乎没有Reg3α的表达，而MIN6/Reg3α细胞中有3株Reg3α(4、5、6)的Reg3α表达水平较MIN6/pcDNA3.1细胞平均升高6～10倍(图1)。

　　2.2 稳定转染细胞及培养液Reg3α的检测结果 采用Western blot方法检测MIN6/Reg3α细胞(5、6)和MIN6/pcDNA3.1细胞vector(6、9)以及MIN6细胞和培养24h的培养液的Reg3α的表达。野生型C57BL/6小鼠4个月经腹腔注射链脲菌素(STZ)后2d，其胰腺Reg3α表达增强(4wt STZ小鼠)，分离胰腺作为阳性对照[6]。在MIN6/Reg3α细胞的培养液中，在蛋白水平上检测到Reg3α蛋白，而MIN6及MIN6/pcDNA3.1细胞及其培养液中几乎无Reg3α蛋白(图2)。

　　2.3 Reg3α对MIN6细胞生长的影响 经MTT法，在低糖、低血清培养7d后，MIN6/Reg3α细胞(5)的平均细胞的数目较MIN6/pcDNA3.1细胞(9)数目升高大约2倍(P<0.01，图3)。

　　3 讨 论

　　本研究首先采用细胞分子生物学方法将小鼠全长的Reg3α cDNA成功克隆到哺乳动物质粒载体pcDNA3.1中。随之稳定转染到胰岛细胞MIN6β细胞瘤株中，并采用Realtime PCR和Western blot方法检测所选3株MIN6/Reg3α细胞系，结果显示Reg3α mRNA和蛋白水平分别平均升高6～10倍，成功建立了所需细胞系。鉴于高葡萄糖，100ml/L胎牛血清浓度环境可能影响观察Reg3α对胰岛细胞株生长的影响，我们采用低葡萄糖(5.6mmol/L)和低胎牛血清(10mL/L)环境下研究Reg3α基因对胰岛β细胞生长的影响。

　　从序列特征上看，Reg家族蛋白应属于C型凝集素超家族，共同特征是由大约120个氨基酸构成钙依赖性碳水化合物识别域(CRD)，并存在于血清、细胞外基质和胞膜上[7]。近年来研究发现：Reg3α在胰腺导管上皮细胞及胰岛α细胞表达，而在胰岛β细胞未发现表达[8]。本研究用Western blot检测，首次发现Reg3α蛋白释放到培养液，提示Reg3α具有内分泌作用。这一研究发现支持Reg家族蛋白质是分泌的和可溶性的，并不结合碳水化合物，可能具有独特的功能。

　　既往研究结果显示：Reg1可促进胰岛细胞分裂和细胞增殖。Reg1基因敲除可使其胰岛生长受限，而胰岛特异性Reg1过表达可使胰岛细胞DNA合成增加。INGAP(Reg3δ)是Reg家族中第二个被发现的蛋白，它可刺激导管细胞转化为新生的胰岛。而有关其他Reg家族蛋白对胰岛细胞生长的研究尚未见报道。本研究采用MTT法证实在低葡萄糖、低血清环境下，与对照空载体转染的MIN6细胞株相比，三株Reg3α稳定转染细胞株，7d后细胞数目升高2倍。表明Reg3α可能亦有促进胰岛细胞分裂和细胞生长的作用，但是尚需在动物水平上进一步证实。

　　细胞内机制研究发现：Reg1与Reg1受体结合，通过激活PI3K，使ATF2磷酸化，而磷酸化的ATF2能够结合位于Cyclin D1基因启动子上游-57～-52位点区，从而激活Cyclin D1的表达，再联合细胞周期依赖激酶(cdks)，使磷酸化视网膜母细胞瘤蛋白(pRb)磷酸化(非活化态)，进而促进细胞分裂周期进程[9]。Reg3α作为一种新的Reg基因家族蛋白，对胰岛细胞增殖作用的细胞内机制是否与Reg1相似，有待进一步研究。

　　【参考文献】

　　[1]TERAZONO K, YAMAMOTO H, TAKASAWA S, et al. A novel gene activated in regenerating islets [J]. J Biol Chem, 1988, 263(5):21112114.

　　[2]LIU JL, CUI W. Which gene, Reg2 or Reg3beta, was targeted that affected liver regeneration [J]. Hepatology, 2007, 45(6):15841585.

　　[3]IOVANNA JL, DAGORN JC. The multifunctional family of secreted proteins containing a Ctype lectinlike domain linked to a short Nterminal peptide [J]. Biochim Biophys Acta, 2005, 25,1723(13):818.

　　[4]OSE T, KADOWAKI Y, FUKUHARA H, et al. Reg Iknockout mice reveal its role in regulation of cell growth that is required in generation and maintenance of the villous structure of small intestine [J]. Oncogene, 2007, 26(3):349359.

　　[5]LIPSETT M, HANLEY S, CASTELLARIN M, et al. The role of islet neogenesisassociated protein (INGAP) in islet neogenesis [J]. Cell Biochem Biophys, 2007, 48(23):127137.

　　[6]LU Y, PONTON A, OKAMOTO H, et al. Activation of the Reg family genes by pancreaticspecific IGFI gene deficiency and after streptozotocininduced diabetes in mouse pancreas [J]. Am J Physiol Endocrinol Metab, 2006, 291(1):E5058.

　　[7]LIU JL, CUI W. Possible roles of Reg family proteins in pancreatic islet cell growth [J]. Endocr Metab Immune Disord Drug Targets, 2008, 8(1):110.

　　[8]NATA K, LIU Y, XU L, et al. Molecular cloning, expression and chromosomal localization of a novel human REG family gene, REG Ⅲ [J]. Gene, 2004, 340(1):161170.

　　[9]TAKASAWA S, IKEDA T, AKIYAMA T, et al. Cyclin D1 activation through ATF2 in Reginduced pancreatic betacell regeneration [J]. FEBS Lett, 2006, 580(2):585591.