PDCD5基因在初诊Graves病患者PBMCs中表达情况的初步研究

　　作者：金秀平，李明，赵杰，马绍杰，贾伟，陈冬，吴乃君，张秀军 作者单位：(华北煤炭医学院：附属医院内分泌科;生物科学系，河北唐山 063000)

　　【摘要】 目的 探讨促凋亡基因PDCD5 mRNA在初诊Graves病(GD)患者外周血单个核细胞(PBMCs)中的表达。方法 半定量RTPCR法检测53例初诊GD患者外周血单个核细胞PDCD5 mRNA表达的阳性率和表达水平。结果 35例PDCD5 mRNA在GD患者PBMCs中表达呈阳性，阳性率为66.1%，较正常对照者(55.6%)升高;其表达水平(1.01±0.13)显著高于正常对照(0.52±0.13，P<0.05)，且GD患者高T3水平组PDCD5 mRNA的表达显著高于低T3水平组(P<0.05)。结论 PDCD5 mRNA 在GD患者PBMC表达升高，可能与GD淋巴细胞凋亡异常有关。

　　【关键词】 PDCD5;Graves病;凋亡;外周血单个核细胞;反转录聚合酶链式反应

　　A preliminary study on the expression of PDCD5 in peripheral blood　monocytes from patients with untreated Graves disease

　　Jin Xiuping, Li Ming, Zhao Jie, Ma Shaojie, Jia Wei,Chen Dong, Wu Naijun, Zhang Xiujun

　　(Department of Endocrinology, the Affiliated Hospital; Department of Biological Sciences,North China Coal Medical College, Tangshan 063000, China)

　　ABSTRACT: Objective To study the expression of PDCD5 in peripheral blood monocytes (PBMCs) from normal subjects and patients with untreated Graves disease (GD). Methods The expression of PDCD5 was assayed by semiquantitative reverse transcriptasepolymerase chain reaction (RTPCR). Results ① Positive rate was significantly higher in GD groups (66.1%) than in normal donor group (55.6%) (P<0.05). ② The relative expression level was also higher in GD groups (1.01±0.13) than in normal donor group (0.52±0.13) (P<0.05). ③ A significantly higher expression of PDCD5 was observed in GD patients with a higher T3 level than that in the lower T3 level patients (P<0.05). Conclusion These results suggest that the higher expression of PDCD5 mRNA may be involved in abnormal apoptosis of lymphocytes in GD patients.

　　KEY WORDS: program cell death 5(PDCD5); Graves disease; apoptosis; PBMC; RTPCR

　　PDCD5(program cell death 5)即程序性细胞死亡因子5是由北京大学人类疾病基因中心从白血病细胞株TF1细胞中克隆得到的，是我国拥有自主知识产权的新功能基因，具有促进多种细胞凋亡和抑制增殖的效应。研究发现PDCD5在桥本病甲状腺滤泡细胞中阳性表达，而在正常甲状腺细胞中几乎不表达[1]。PDCD5在初诊未治疗的GD患者中的表达情况尚未见报道。为此，我们通过半定量RTPCR方法测定了35例GD患者外周血单个核细胞PDCD5 mRNA的表达情况，并探讨了PDCD5的表达与GD病的相关性。

　　1 材料与方法

　　1.1 研究对象与主要试剂 研究对象：GD组为目的基因阳性表达的患者35例(男8例，女27例)，平均年龄(40.20±14.51)岁，均为就诊于我院内分泌科门诊或病房的患者，均未给予抗甲状腺治疗。依临床表现、甲状腺功能检测结果以及甲状腺核素扫描等临床诊断，确定为Graves病。所选对象均为初诊患者，且无其他自身免疫性疾病、肿瘤及内分泌疾病病史。按T3水平分为GD1(T3<4μg/L)组16例，GD2(T3≥4μg/L)组19例。正常对照组(NC)18例，为本院健康查体人员，其中10例(男2例，女8例)目的基因呈阳性表达，平均年龄(38.10±11.28)岁。主要试剂：Trizol RNA提取试剂和2×Taq PCR MasterMix均购自天根生化科技(北京)有限公司，MMLV逆转录试剂盒购自PROMEGA公司。

　　1.2 细胞的分离 取研究对象的静脉血，EDTA抗凝，按常规用Ficoll密度梯度离心分离单个核细胞(peripheral blood monocytes，PBMCs)。

　　1.3 半定量RTPCR检测PDCD5基因的表达 mRNA的提取按Trizol总RNA分离试剂盒说明书进行。离心收集约1×106细胞，顺次加入Trizol提取液、氯仿、异丙醇提取细胞的总RNA。紫外分光光度仪分别在260nm和280nm波长下分析RNA的吸光值，测定RNA的纯度并定量。cDNA合成按MMLV逆转录酶产品说明书推荐的方法。在0.2mL Ep管中分别加入2μg总RNA、Oligo(dT)18、dNTP、5×MMLV逆转录酶缓冲液、DTT、Rnasin、MMLV逆转录酶和DEPC H2O，反应体系为40μL。逆转录条件为：37℃ 1h，然后72℃ 10min。PCR反应：取2μL cDNA，加入PDCD5特异性的引物、2×Taq PCR MasterMix和去离子水，反应体系为50μL。PDCD5引物序列为：上游引物5′CAACAGGAA GCAAAGCAC3′;下游引物为5′GATCTTAACTTCTGTCCTAGAC3，扩增片段长度为384bp。以βactin为内参照，其引物序列为：上游引物5′CCCAGGCACCAGGGCGTGATGGT3′;下游引物为5′GGACTC CATGCCCAGGAAGGAA3′，扩增片段长度为701bp。PCR反应条件为： 94℃ 3min预变性，然后94℃ 40s变性，61℃ 45s退火，72℃ 50s延伸，共35个循环，最后72℃ 10min结束反应。将8μL PCR产物加样至10g/L(1%)琼脂糖凝胶样品孔中，在1×TAE电泳缓冲液中电泳鉴定PCR产物，紫外灯下观测电泳结果， BIORADGD2000凝胶成像系统照相记录实验结果，用Quantity One软件测定每个条带的吸光值，并计算样品PDCD5条带与内参照βactin条带的吸光度比值。用相对吸光度单位表示mRNA表达量, 相对吸光度单位=PDCD5吸光度单位/βactin吸光度单位×100%。PCR产物的测序与DNA同源性分析：为证实PCR产物确为PDCD5扩增片段，对扩增产物进行直接序列测定，将50μL(约5μg) 已纯化的PCR产物送上海生工生物工程技术服务有限公司进行DNA序列测定。测序结果应用BLAST软件与GenBank序列进行同源性分析。

　　1.4 统计学处理 应用SPSS11.0统计软件进行数据统计与分析，各组结果以±s表示，各组之间均数比较用t检验，PDCD 5基因阳性率的比较用χ2检验。

　　2 结果

　　2.1 序列测定 PDCD5基因PCR扩增产物进行双向序列测定，经与GenBank序列对比，同源性均为100%，证实PCR产物的正确性。

　　2.2 正常人外周血单个核细胞PDCD5基因的表达 在mRNA水平上，用RTPCR方法研究了正常查体人员PBMCs PDCD5基因的表达。结果表明，PDCD5的mRNA在正常人外周血单个核细胞中表达的阳性率55.6%，表达量平均为0.52±0.13。

　　2.3 Graves病患者外周血单个核细胞PDCD5基因的表达 35例GD患者PDCD5 mRNA呈阳性表达，表达阳性率为66.1%，其平均表达强度为1.01±0.13，经χ2检验，正常对照组与GD组PDCD5阳性率无统计学差异。经t检验，外周血单个核细胞PDCD5 mRNA的表达强度在GD组显著高于正常对照组(1.01±0.13 vs. 0.52±0.13, P<0.01)。

　　2.4 GD患者不同T3浓度组甲状腺功能的测定、血清TRAb与PDCD5mRNA的表达 高T3组血清TRAb、T4、FT3、 FT4高于低T3水平组(P<0.05)。高T3组外周血单个核细胞PDCD5 mRNA的表达强度为1.26±0.43，显著高于低T3水平组该基因表达的强度(0.94±0.33，P<0.05，表1)。

　　表1 GD1组和GD2组甲状腺功能水平与PDCD5mRNA的表达水平的比较(略)

　　Table 1 Comparison of PDCD5 mRNA expression and glandula thyreoiden functional level in each group

　　*P<0.05 vs. GD1 group

　　3 讨论

　　PDCD5又称为程序性细胞死亡因子5，其基因定位于19q12-q13.1，由6个外显子和5个内含子组成。PDCD5有促进多种细胞凋亡和抑制增殖的效应,不仅在细胞凋亡时表达增加，而且凋亡早期就出现明显的核转位现象[2]。该因子可与Caspase3特异性结合，提高Caspase3蛋白的活性[3]。单独存在时不具备诱导凋亡的作用，但与其他凋亡诱导剂同时存在时则可明显促进凋亡进程。GD是一种器官特异性自身免疫性甲状腺病。其发病主要是由于致敏淋巴细胞产生的TRAb作用于甲状腺滤泡细胞产生大量的甲状腺激素引起，自身反应性淋巴细胞的活化及其与共刺激分子CD40/CD40L、ICOS/GL50等的相互作用是该病发展过程中的启动环节。关于GD外周血单个核细胞凋亡情况的报道较少。我们研究PDCD5基因在外周血单个核细胞的表达情况尚属首次。Cebrian M等[4]认为未治疗的GD患者外周血T淋巴细胞表达HLADR,CD25和CD69，表明淋巴细胞浸润甲状腺组织之前已经在外周活化。自身免疫反应过程不仅局限于甲状腺，有50%以上的GD患者合并甲状腺相关性眼病[5]，还有部分患者合并皮肤受累。所以，我们选择了外周血单个核细胞作为研究对象。细胞凋亡在维持组织的自身平衡、控制异常细胞的生长以及调节免疫反应中起重要作用，是限制外周循环中自身反应性T细胞过度增殖的重要方式。破坏细胞凋亡平衡将会引起自身免疫的紊乱，引发自身免疫性疾病。GD外周血淋巴细胞凋亡的机制复杂，涉及多种凋亡相关因子。Feldkamp[6]研究了包括112名GD患者在内的甲亢患者，发现其血清中可溶性Fas(sFas)水平增高，经抗甲状腺药物治疗甲状腺功能正常后sFas恢复正常。 Maruoka[7]认为在病情严重的自身免疫性甲状腺病患者外周T淋巴细胞Fas表达增高。本研究中，GD患者外周血淋巴细胞PDCD5 mRNA的表达显著高于正常对照者。表明PDCD5可能是继Fas、Bcl2和TRAIL[8]等经典凋亡途径之后又一新的影响GD免疫细胞凋亡平衡的因子。Shoji等[9]用T3和T4培养的正常人外周淋巴细胞及T淋巴细胞系发现其表达抗凋亡蛋白Bcl2减少。推测虽然外周血促凋亡因素与抑凋亡因素均发生了改变。但是，自身反应性淋巴细胞能抵抗细胞凋亡的发生。该研究还发现随T3浓度升高，淋巴细胞凋亡数也随即增加，同时他们还观察到随激素水平的增加，淋巴细胞中抗凋亡分子Bcl2表达下降。本研究对病例组根据血清T3水平分组后的分析也发现高T3组PDCD5 mRNA的表达显著高于低T3组，随着GD病情加重，升高的甲状腺激素造成PDCD5 mRNA的表达增高。但是，PDCD5影响GD凋亡平衡的具体机制需进一步研究。

　　基金项目：科技部“功能基因组与生物芯片”重大专项资助项目(No.2002BA711A0101)

　　【参考文献】

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　　[2]Chen YY, Sun RH, Han WL, et al. Nuclear translocation of TFAR19 (PDCD5): an early signal for apoptosis [J]. FEBS letter, 2001, 509(27):191196.

　　[3]Liu H, Wang Y, Zhang Y, et al. TFAR19, a noval apoptosis related gene cloned from human leukemia cell line TF1, could enhance apoptosis of some tumor cells induced by growth factor withdrawal [J]. Biochem Biophys Res Commun, 1999, 254(1):203210.

　　[4]Cebrian M, Yague E, Rincon M,et al. Triggering of T cell proliferation through AIM, an activation inducer molecule expressed on activated human lymphocytes [J]. J Exp Med, 1988, 168(5):16211637.

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　　[6]Feldcamp J, Pascher E, Schott M, et al. Soluble fas is increased in hyperthyroidism independent of the underlying thyroid disease [J]. J Clin Endocrinol Metab, 2000,86(9):42504253.

　　[7]Maruoka H, Watanaba M, Matsuzuka F, et al. Increased intensities of fas expression on peripheral Tcell subsets in severe autoimmune thyroid disease [J]. Thyroid, 2004, 14(6):417423.

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　　[9]Shoji M, Noboru S, Sueshige W, et al. Effects of thyroid hormones on apoptotic cell death of human lymphocytes [J]. J Clin Endocrinol Metab, 1999, 84(4):13781385.