CD40基因多态性与自身免疫性甲状腺病的相关性

　　作者：张怡 作者单位：西安交通大学医学院第一附属医院内分泌科，陕西西安 710061

　　【摘要】 目的 了解CD40基因多态性在西北地区汉族人群中的分布及其与自身免疫性甲状腺病(AITD)的相关性。方法 随机选取本院内分泌科门诊的165例Graves病(GD)患者、113例桥本甲状腺炎(HT)患者为研究对象，以94例健康体查者为对照。①应用聚合酶链反应限制性酶切片段长度多态性技术检测CD40基因5′非翻译区1位点C/T多态性(5′UTR C(1)T)、第三外显子58038位点-/T多态性;②应用扩增受阻突变系统-聚合酶链反应检测第九外显子64610位点C/G多态性。结果 ①5′UTR C(1)T位点中CC基因型、C等位基因在GD组和对照组间有显著差异(P<0.05);②58038位点在372例样本中均为TT型;③64610位点未发现GG基因型。结论 ①西北地区汉族人CD40基因5′UTR C(1)T位点上C等位基因型与GD发病有相关性，CC基因型者患GD的危险性较TT高;②58038位点-/T在西北地区汉族人中无多态性;③64610位点C/G在西北地区汉族人中未发现GG基因型。

　　【关键词】 自身免疫性甲状腺病 CD40基因 单核苷酸多态性

　　Association of CD40 gene 5′UTR C(1)T, 58038T and C64610G　polymorphism with autoimmune thyroid disorders

　　Zhang Yi, Zhu Benzhang, Sun Yan

　　(Department of Endocrinology, the First Affiliated Hospital, Medical School of　Xian Jiaotong University, Xian 710061; Intensive Care Unit,Shaanxi Provincial Peoples Hospital, Xian 710068, China)

　　ABSTRACT: Objective To investigate polymorphism of CD40 gene and its relation with autoimmune thyroid disorders (AITD) in Chinas Northwest region. Methods The study recruited 372 subjects: 165 Graves disease (GD) and 113 Hashimotos thyroiditis (HT) and 93 healthy subjects as controls. ① Using PCRrestriction fragment length polymorphism (PCRRFLP) to analyze the C/T polymorphism in the 5′UTR and the 58038T point mutation in exon3. ② Using amplification refractory mutation systemPCR (ARMSPCR) to analyze the C64610G point mutation in exon9. Results ① There were significant differences in allele frequencies of C and genotype CC between GD group and control group in 5′UTR C(1)T (P<0.05). ② We only found TT gene type in 58038 T in the 372 subjects. GG gene type was not found. Conclusion ① The CD40 gene 5′UTR C(1)T polymorphism is associated with GD and C allele appears to be a risk factor for GD in Han of Chinas Northwest region. ② We found no polymorphism in 58038T in Han of Chinas Northwest region. ③ We found no GG gene type in C64610G in Han of Chinas Northwest region.

　　KEY WORDS: autoimmune thyroid disorder; CD40 gene; single nucleotide polymorphism; polymerase chain reaction combined with restriction fragment length polymorphism; amplification refractory mutation system

　　自身免疫性甲状腺病(autoimmune thyroid disorders, AITD)主要包括Graves病(GD)、桥本甲状腺炎(HT)及特发性黏液性水肿。自身免疫反应为本病的中心环节，而CD40属于正性共刺激分子，起着上调免疫反应的作用，在AITD的发病及病情进展中起着重要作用 。国外关于CD40基因多态性与GD的关系虽有研究但结论尚有争议，而国内尚无报道。本文关于CD40基因58038T、C64610G位点的多态性在中国人群中的研究尚属首次。

　　1 对象与方法

　　1.1 研究对象 研究对象均选自本院内分泌科门诊患者，无其他自身免疫病病史。①GD组：165例，男性32例，女性133例，平均年龄(35.33±13.11)岁。根据临床症状、体征、甲状腺激素水平升高、促甲状腺素(TSH)降低、促甲状腺激素受体抗体(TSHRAb)(+)入选。②HT组：113例，男性8例，女性105例，平均年龄(35.66±12.09)岁。根据临床症状、体征、甲状腺功能测定、甲状腺过氧化物酶抗体(TPOAb)(+)入选。正常对照组：均为健康体查者，共94例，男性28例，女性66例，平均年龄(37.38±13.58)岁。选入者个人及家族无甲状腺病史，无甲状腺肿，检测甲状腺功能正常，甲状腺自身抗体(-)。

　　1.2 基因组DNA提取 EDTA抗凝静脉血200μL，应用chelex100提取DNA。Chelex100购自BioRad公司。

　　1.3 CD40基因5′UTR C(1)T位点PCR扩增及基因型分析

　　1.3.1 PCR扩增 本实验引物均由北京奥科生物技术有限公司合成，引物设计参照文献[1]序列：上游5′TGGGAATGTTCTGGGGAA3′，下游5′AGGCCTCTTCCCCGAA3′。体系为(20μL)2×Taq PCR MasterMix 10μL、上下游引物各1μL、模板DNA 3μL，其余以灭菌双蒸水补足。PCR反应条件：94℃预变性5min后进入循环，94℃变性30s、58℃退火30s、72℃延伸45s。共30个循环。末次循环后72℃延伸7min。

　　1.3.2 基因型分析 5μL扩增产物经NcoⅠ酶切后，80g/L聚丙烯酰胺凝胶电泳银染确定基因型。NcoⅠ内切酶购自宝生物公司。

　　1.4 第三外显子58038T PCR扩增及基因型分析

　　1.4.1 PCR扩增 引物利用生物软件Primer premier5设计，序列为：上游引物5′CCCACTCTGGAAGCTCTTCGT3′，下游引物5′CTGGAGCAGCAGTGTTGGAG3′。体系为(20μL)2×Taq PCR MasterMix 10μL、上下游引物各1μL、模板DNA 3μL，其余以灭菌双蒸水补足。94℃预变性5min后进入30个循环：94℃变性30s、57℃退火30s、72℃延伸45s，末次循环后72℃延伸7min。

　　1.4.2 基因型分析 PCR扩增产物5μL经MvaⅠ酶切后，30g/L琼脂糖凝胶电泳确定基因型。MvaⅠ内切酶购自宝生物公司。

　　1.5 第九外显子C64610G ARMSPCR检测

　　1.5.1 PCR扩增 引物利用生物软件Primer premier5设计，序列为：上游引物①5′ACCTTGCCTCTCCAGGCCC3′，上游引物②5′ACCTTGCCTCTCCAGGCCG3′，下游引物5′AAGCAGCTTCCAGTTGTTCACTAT3′。体系为(20μL)2×Taq PCR MasterMix 10μL、上下游引物各1μL、模板DNA 3μL，其余以灭菌双蒸水补足。94℃预变性5min后进入30个循环：94℃变性30s、68℃退火30s、72℃延伸45s。末次循环后72℃延伸7min。

　　1.5.2 基因型分析 PCR扩增产物可直接判定基因型。

　　1.6 统计学处理 应用SPSS11.0统计软件包对各组实验数据进行处理。各组间基因频率和等位基因频率的比较用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 5′UTR C(1)T位点的酶切结果 CD40基因5′UTR C(1)T位点上有C或T碱基的变化，根据限制性内切酶NcoⅠ酶切片断的情况基因型有3种(图1)：CC基因型(184bp、136bp两条带)、TT基因型(320bp一条带)、CT基因型(320bp、184bp、136bp三条带)。

　　图1 NcoⅠ酶切 5′UTR C(1)T 位点的PCR扩增产物(略)

　　Fig.1 Identification of 5′UTR C(1)T PCR pruducts by NcoⅠ restriction

　　M: DNA marker; 1, 12, 13: heterozygote genotype CT; 2-11, 14: homozygote genotype CC; 15: homozygote genotype TT

　　2.2 第三外显子58038T位点的酶切结果

　　

　　58038T位点上有缺失或T碱基的变化，根据限制性内切酶MvaⅠ酶切片断的情况基因型有3种：TT基因型(82bp、126bp两条带)、缺失基因型(208bp一条带)、CT基因型(82bp、126bp、208bp三条带)，基因型检测结果全部样本为82bp、126bp两条带，即TT基因型(图2)。

　　图2 MvaⅠ酶切58038 -/T位点的PCR扩增产物(略)

　　Fig.2 Identification of 58038 -/T PCR pruducts by MvaⅠ restriction

　　M: DNA marker; 1-5: homozygote genotype TT

　　2.3 第九外显子C64610G位点的PCR结果 ARMSPCR扩增CD40基因包含C64610G位点的DNA序列，不同的上游引物可分别结合不同基因型位点，372例样本中3例CG基因型，其余为CC基因型。1、2、5、6所示为2例CC基因型标本，3、4所示为1例CG基因型(图3)。

　　图3 C64610G位点的PCR扩增产物(略)

　　Fig.3 PCR pruducts of C64610G

　　M: DNA marker; 1, 2, 5, 6: homozygote genotype CC; 3, 4: heterozygote genotype CT

　　2.4 5′UTR C(1)T位点的多态性分析 GD组CC基因型频率及C等位基因频率显著高于对照组(OR分别1.74、1.603，P均<0.05)。HT组CC基因型频率及C等位基因型频率与对照组比较基本相当，差异无统计学意义(P>0.05，表1)。

　　表1 正常对照组和患者组5′UTR C(1)T位点基因型及等位基因频率的比较(略)

　　Table1 Genotype distribution and allele frequency of the 5′UTR C(1) T polymorphism in patients and controls

　　*P<0.05 vs. control group. GD: Graves disease; HT: Hashimotos thyroiditis

　　3 讨论

　　Kim等[1]对韩国人的研究及Tomer等[2]对高加索人种的研究认为CD40基因5′UTR C(1)T中CC基因型与GD相关，而Heward等[3]对高加索人种的研究却显示C等位基因与GD无关。目前有关58038T、C64610G多态性与AITD的关系尚未见报道。

　　我们的研究结果表明，58038T位点在西北地区汉族人中未发现突变;C64610G位点在西北地区汉族人中未发现GG基因型，C、G频率分别为0.992、0.008，无多态性，故不讨论其与AITD的相关性。

　　在CD40基因5′UTR C(1)T位点的研究中我们与Kim等人的结果一致，即C等位基因型与GD病的发病有相关性，CC基因型者患GD病的危险性较TT者高。CD40基因5′UTR C(1)T位于CD40基因翻译起始密码子前一位上，而围绕在起始密码子ATG上下游的一段约6-8而个碱基序列称为Kozak序列，其中起始密码子前的一个核苷酸序列为翻译时核糖体结合部位，T基因变成C基因使Kozak序列发生改变，影响到基因的翻译表达，最终影响CD40分子的表达水平，若CD40表达增多，自身免疫反应的强度会加大。从而促使GD发病。

　　然而HT的发病亦以自身免疫反应为基础，我们的结果却只显示5′UTR C(1)T位点多态性与GD病相关。CD40可能在两种疾病发病中的作用强度不同，GD病主要以体液免疫为主，而HT以细胞免疫为主。根据现有研究，CD40在体液免疫中作用可能更为重要，CD40不仅介导T细胞和B细胞之间的相互作用，而且几乎表达于B细胞分化与发育的全过程，贯穿B细胞分化发育的各个阶段。在GD病患者中CD40异常表达于甲状腺上皮细胞，并可使甲状腺细胞呈递自身抗原给T细胞从而开启自身免疫应答;CD40及其配体的相互作用进一步促使B淋巴细胞产生TsAb，从而导致GD发病。若能再进一步研究CD40的表达水平将更有力的说明此种影响。

　　本研究结果支持CD40基因5′UTR C(1)T多态性与GD有相关性，C等位基因者倾向发病。但是该多态性与CD40分子的生理功能方面的关系还需进一步研究;CD40基因5′UTR C(1)T位点和CD40基因其他的多态性位点的关系还有待研究;CD40基因和AITD的其他相关基因的关系也将是今后研究的重点。

　　【参考文献】

　　[1]Kim TY, Park YJ, Hwang JK, et al. A C/T polymorphism in the 5'untranslated region of the CD40 gene is associated with Graves disease in Koreans [J]. Thyroid, 2003, 13(10):9191025.

　　[2]Tomer Y, Concepcion E, Greenberg DA. A C/T singlenucleotide polymorphism in the region of the CD40 gene is associated with Graves disease [J]. Thyroid, 2002, 12(12):11291235.

　　[3]Heward JM, Simmonds MJ, CarrSmith J, et al. A single nucleotide polymorphism in the CD40 gene on chromosome 20q (GD2) provides no evidence for susceptibility to Graves' disease in UK Caucasians [J]. Clin Endocrinol (Oxf), 2004, 61(2):269872.