EPO对早期糖尿病大鼠肾脏的保护作用

　　作者：凌厉，朱本章 作者单位：西安交通大学医学院第一附属医院内分泌科，陕西西安 710061

　　【摘要】目的 观察亚临床剂量EPO对糖尿病大鼠早期肾损伤的影响，并探讨其作用机制。方法 将大鼠随机分为正常对照组(NC)、糖尿病组(DM)及糖尿病EPO干预的两个剂量亚组(DMTA和DMTB)。采用链脲佐菌素诱导1型糖尿病大鼠模型，腹腔注射EPO 10周后，测定血糖、血压、血红蛋白、肾功能;光镜及电镜下观察肾组织形态学变化;免疫组化分析肾组织细胞凋亡相关蛋白Bcl2/Bax及细胞因子VEGF的表达。结果 实验剂量EPO干预后，大鼠肾功能及其形态学指标得到显著改善;Bcl2/Bax比值及VEGF表达升高;均呈剂量依赖性。血糖、血压、血红蛋白值与对照组相比无明显变化。结论 亚临床剂量EPO可延缓早期糖尿病肾病发展进程，可能与上调Bcl2/Bax蛋白表达比值，抑制肾脏细胞凋亡有关;在本实验条件下，肾组织VEGF的表达上调未对糖尿病肾病造成不良影响。

　　【关键词】 糖尿病肾病;促红细胞生成素;细胞凋亡;Bcl2/Bax;血管内皮生长因子;大鼠

　　Protective effect of EPO on early diabetic rats kidney

　　Ling Li, Zhu Benzhang

　　(Department of Endocrinology, the First Affiliated Hospital,Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710061, China)

　　ABSTRACT: Objective To study the effect of subclinical dosage of EPO on early renal lesions of diabetic rats. Methods The rats were randomly divided into normal control group (NC), diabetic group (DM), diabetic rats treated with Adosage EPO (DMTA), and diabetic rats treated with Bdosage EPO (DMTB). Diabetic rats induced by STZ were given EPO intraperitoneally for 10 weeks; then blood glucose, blood pressure, renal function indexes, renal morphological parameter, the expression of cell apoptosis associated protein Bcl2/Bax and VEGF were measured. Results After treatment of EPO, renal functional and morphological indexes were improved significantly and the ratio of Bcl2/Bax and VEGF increased, both in a dosedependent manner. Blood sugar, blood pressure and hemoglobin concentration had no significant differences. Conclusion Subclinical dosage of EPO could play an advantageous role in diabetic nephropathy. Inhibition of cell apoptosis by upregulation of Bcl2/Bax expression rate may be responsible for renal protective effects despite the upregulation of VEGF.

　　KEY WORD: diabetic nephropathy; EPO; cell apoptosis; Bcl2/Bax; VEGF; rat

　　贫血在糖尿病人群中高发，包括糖尿病早期无明显肾损害的患者[1]。大量研究证实，贫血与糖尿病的微血管及大血管病变的产生和发展,以及患者的住院率和死亡率均有关系，是判断糖尿病及其并发症预后的一大危险因素[2]。糖尿病合并贫血的患者多存在EPO的绝对或相对缺乏[1]。应用外源性EPO治疗时，除了纠正贫血，对早期糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)发生发展的影响，国内外尚缺乏相关报道。本实验观察亚临床剂量EPO干预对早期DN动物模型的肾功能及肾组织形态学影响，并通过凋亡相关蛋白Bcl2/Bax及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)的表达来探讨其部分作用机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 试剂与仪器

　　链脲佐菌素(streptozotocin, STZ，Sigma公司)，依倍TM注射用重组人促红素(recombinant human erythropoietin, rhEPO，成都地奥九泓制药厂)，大鼠专用尿白蛋白放免试剂盒(天津九鼎医学生物工程有限公司，批内变异系数为3.1%-5.8%)，Bcl2多克隆抗体和Bax多克隆抗体(北京博奥森生物技术有限公司)，VEGF多克隆抗体(美国NeoMarkers公司)，EliVisonTMplus广谱试剂盒(福州迈新生物技术开发有限公司)，HITACHI 7170自动生化分析仪(日本)，H600型透射式电子显微镜(日本)，Motic Image Advanced 3.2高级图像处理软件。

　　1.2 造模方法与分组

　　雄性SD大鼠(体重200-260g)44只，随机取10只作为正常对照(NC组);余34只予腹腔注射STZ 60mg/kg制备糖尿病模型，3d后测血糖>16.7mmol/L持续10d，确定为糖尿病模型制备成功[3]。成模率100%。将成模大鼠随机分为糖尿病非治疗组(DM组)12只;小剂量EPO干预组(DMTA组)11只，给予rhEPO 30u/kg，每周3次腹腔注射;大剂量EPO干预组(DMTB组)11只，给予rhEPO 50u/kg，每周3次腹腔注射。以上干预剂量为亚临床剂量，对实验动物的血压和血红蛋白值均不产生显著影响，参考Yalcin[4]及Lee等[5]的研究，并由预实验获得。干预治疗10周后检测相应各项指标。期间，DM、DMTA、DMTB三组大鼠隔日注射鱼精蛋白锌胰岛素2u，以防止其血糖过高导致酮症酸中毒而死亡。实验结束时,死亡4只(DM组2只，DMTA及DMTB组各1只)，病死率12%，无自发缓解。

　　1.3 生化指标检测

　　①代谢笼留取大鼠24h尿液，测定24h尿白蛋白排泄率(albumin exeretion rate, AER)和尿肌酐值;②大鼠称重后，10g/L戊巴比妥钠(按50mg/kg体重)腹腔注射麻醉，右侧颈动脉插管测血压;③用肝素抗凝管收集0.5mL动脉血，测血糖、血红蛋白及血肌酐值;肌酐清除率=尿肌酐×每分钟尿量/血肌酐。

　　1.4 肾重及形态学检测

　　①剖腹取肾，称重(左肾)，计算肾重/体重比值;②左肾于100mL/L甲醛固定，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，4μm连续切片，备作HE及免疫组化;③右肾取皮质，以25mL/L戊二醛和10mL/L锇酸双重固定、脱水、Epon812工作液包埋、切片、醋酸双氧铀及柠檬酸铅双重染色，电镜下观察组织形态学改变;每例标本随机取3张不同部位的照片，用图像处理系统对肾小球基底膜进行定量检测，取其均值作为每例标本的肾小球基底膜厚度。④常规HE染色，光镜400倍下，每张切片用图像摄入处理系统检测皮质区经肾门正切的5个肾小球，计算肾小球平均截面积。

　　1.5 肾组织免疫组化染色

　　①Bcl2/Bax免疫组织化学染色(EliVisionTMplus二步法)：一抗为Bcl2多克隆抗体和Bax多克隆抗体，分别予1∶100稀释，加一抗前予柠檬酸缓冲液(0.01mol/L, pH 6.0)高温高压抗原修复，30mL/L过氧化氢溶液阻断内源性过氧化物酶，其他步骤严格按照EliVisonTMplus广谱试剂盒说明书进行，经DAB显色，苏木素复染，以PBS替代一抗做阴性对照。阳性细胞胞质呈棕色或棕黄色。在光镜下观察阳性染色的部位、范围;用上述计算机图像分析系统随机测定每张切片5个视野(×400)中阳性目标的灰度值，取其均值记录;②VEGF免疫组织化学染色：一抗为VEGF多克隆抗体，予1∶200稀释，加一抗前予TrisHCl缓冲液(0.01mol/L，pH 8.0)高温高压抗原修复，其他步骤同Bcl2/Bax。

　　1.6 统计学处理

　　计量资料以均数±标准差 (±s)表示，用 SPSS10.0(USA)统计软件作数据处理分析。多组间比较用单因素方差分析、LSDt检验，非正态分布资料经正态转换后再进行统计学处理，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 各组大鼠一般情况的比较

　　NC组体形适中，毛发平伏有光泽，反应灵敏;DM组大鼠消瘦，毛竖无光泽，弓背蜷体，精神萎靡，反应迟钝，饮水量、食量及尿量显著增加。DMTA组和DMTB组症状表现介于两者之间，DMTB组出现明显改变的时间迟于DMTA组。大鼠各项生理指标的比较见表1和表2。表1 各组大鼠血糖、体重增值、肾重/体重、内生肌酐清除率、尿白蛋白的比较(略)表2 各组大鼠血压及血红蛋白值的比较(略)

　　2.2 各组大鼠肾脏病理形态学的比较

　　HE染色光镜下观察显示，DM组大鼠肾组织病变主要表现为肾小球毛细血管袢扩张，肾小球肥大;透射电镜下观察超微结构显示肾小球基底膜局部增厚，脏层上皮细胞足突轻度融合，结构紊乱，系膜区系膜基质及系膜细胞轻度增生(图1)。EPO干预后上述改变减轻(图2、表3)。表3 各组大鼠肾小球平均截面积及肾小球平均基底膜厚度的比较(略)

　　2.3 各组大鼠肾组织免疫组化指标的比较

　　各组大鼠肾组织中细胞凋亡相关Bcl2/Bax蛋白和VEGF均有不同程度的表达。Bcl2主要位于肾小管(图3、图4);Bax在肾小管、肾小球都有表达;VEGF主要位于肾小球足细胞(图5、图6)。采用阳性目标平均灰度值(与阳性表达强度成反比关系)记录阳性表达强度(表4)。表4 各组大鼠肾组织免疫组化指标阳性目标平均灰度值的比较(略)

　　3 讨 论

　　近年来，随着研究的不断进展,人们对EPO的认识产生了很大的飞跃，已证实其对中枢神经系统[6]、心脏[7]、血管内皮[8]等多种脏器组织具有保护作用。其中，研究最成熟的是其在脑缺血及其他代谢性应激中的中枢神经系统的保护作用[9]，被证实有抗凋亡、抗炎症、促进神经干细胞和祖细胞增殖分化及神经营养作用[10]。肾脏是产生EPO的主要脏器。早在1999年，Westenfelder首次报道了具有活性的EPO受体在人及啮齿类动物肾脏细胞的表达，提出EPO可能通过某些细胞因子的作用而对肾脏具有保护作用 [11]。已有文献报道rhEPO可减轻缺血再灌注及肾毒性药物(如顺铂,环孢素A)对肾脏的急慢性损害[1216]，认为可能与其抗凋亡作用有关。前瞻性随机双盲临床实验证实，早期应用EPO能显著延缓非DN患者肾功能衰竭的进程[17]。但均缺乏DN相关数据。本研究试图弥补该项不足。

　　VEGF又称为血管通透性因子(vascular permeability factor, VPF)，是DN早期微量白蛋白尿的主要原因之一，在糖尿病肾病的发生发展中起到了关键性作用[18]。rhEPO能在体外上调VEGF受体，即Flt1和KDR/Flk1在小牛主动脉内皮细胞(bovine aorta endothelial cell, BAEC)的表达[19]。但后来的一项临床实验证明无论是肾功正常或是肾功不全的糖尿病患者，其内源性的EPO水平都未影响VEGF/Flt1系统[20]。外源性EPO对糖尿病活体内肾组织VEGF表达的影响尚未见报道。

　　本实验采用单次腹腔注射STZ制备Ⅰ型糖尿病大鼠模型，在不显著升高大鼠血压及血红蛋白值的前提下，设计了两组不同剂量EPO，观察其对早期DN的影响，并探讨其部分作用机制。实验结果表明：亚临床剂量EPO干预显著降低糖尿病大鼠尿白蛋白排泄率与内生肌酐清除率，减轻肾脏肥大及肾组织病理形态学改变，呈剂量依赖性，而血糖值无明显变化，说明EPO延缓糖尿病肾病发展的机制可能是对糖尿病肾脏组织直接作用的结果。EPO干预后使Bax蛋白表达下降、Bcl2蛋白表达增加， Bcl2/Bax蛋白表达比值显著升高，表明EPO对糖尿病肾病的保护作用部分是通过上调Bcl2/Bax蛋白比值，减少肾脏细胞凋亡而实现的。同时，本实验还证实外源性EPO能上调VEGF在肾组织的表达，但在该实验条件下未对肾脏造成不良影响。

　　除了其强大的抗凋亡作用，EPO抗炎机制亦可能对DN产生有利影响[6]。在临床贫血的治疗过程中，EPO尚可通过纠正贫血，改善组织氧供，减少低氧诱导的细胞凋亡，从而缓解DN的发展。本实验结论能否进一步推广，EPO在什么剂量范围内，或血红蛋白值控制在什么范围内对DN患者最为有利，需要更多的研究，尤其是临床研究及循证学依据。

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