人促甲状腺素受体膜外区基因克隆及真核表达

　　作者：李雪萍1,3，施秉银1，武 敏1，伍丽萍1，刘陕西2 作者单位：(西安交通大学医学院第一附属医院：1. 内分泌科;2. 血液科，陕西西安 710061;3. 西安医学院临床医学系，陕西西安 710068)

　　【摘要】 目的 克隆人促甲状腺激素受体胞外段基因，构建重组真核表达质粒，获得具有免疫学活性的纯化重组蛋白。方法 应用RTPCR技术从人甲状腺组织得到TSHR膜外区cDNA，插入真核表达载体pcDNA3.1(+),转染CHO细胞,RTPCR鉴定基因转录，用免疫细胞化学染色法和Western Blot鉴定表达蛋白。结果 经测序证实筛选得到的重组体中存在序列正确的TSHR膜外区基因，表达蛋白具有免疫活性。结论 成功克隆了人促甲状腺素受体膜外区基因和构建了真核表达载体,并将其在真核细胞中成功表达。

　　【关键词】 自身免疫性甲状腺疾病;人促甲状腺素受体;基因重组;真核表达

　　Gene cloning and expression of human TSHR

　　ectodomain in eukaryotic cellsLI Xueping1,3, SHI Bingyin1, WU Min1, WU Liping1, LIU Shaanxi2

　　(1. Department of Endocrinology; 2. Department of Hematology, the First Affiliated Hospital,

　　Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710061;

　　3. Department of Clinical Medicine, Xian Medical College, Xian 710068, China)ABSTRACT: Objective To clone and construct the plasmid containing human thyroid stimulating hormone receptor (TSHR) gene ectodomain, and then identify the immunoreactivity of the purified recombinant protein. Methods TSHR total RNA was extracted from human thyroid, and cDNA was obtained with RTPCR technique. Human TSHR ectodomain gene (hETSHR) was cloned into pcDNA3.1(+) vector. The recombined construct was transfected into CHO cells by Lipofectin 2000. The transcript mRNA was detected by RTPCR, and protein immunoreactivity was assayed by TSHR antibody with immunocytochemistry staining and Western blot. Results DNA sequencing results showed that the recombinant of human thyrotropin receptor ectodomain had confirmed sequence reported in GenBank. The fusion protein had the immunoreactivity. Conclusion Human thyroid stimulating hormone receptor was successfully cloned in eukaryotic expression vector and the constructor was expressed in eukaryotic cells very well.

　　KEY WORDS: autoimmune thyroid disease; human thyroid stimulating hormone receptor; gene recombination; eukaryotic expression

　　人促甲状腺素受体(thyroid stimulating hormone receptor, TSHR)存在于甲状腺细胞膜上，对甲状腺正常生长、发育及功能维持发挥着重要作用，同时也是自身免疫性甲状腺疾病(autoimmune thyroid disease, AITD)最重要的自身抗原[1]。机体产生针对TSHR的自身抗体(thyroid receptor antibody, TRAb)是其主要的发病机制。由于存在于甲状腺细胞膜上的TSHR数量少，结构不稳定，且难以纯化，无法开展TSHR的进一步研究。本文从人甲状腺中提取RNA，通过逆转录获得TSHR膜外区cDNA，构建真核表达载体，体外表达了TSHR蛋白，为进一步建立新的AITD自身抗体检测方法、建立AITD动物模型等奠定了基础。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 甲状腺组织取自患者手术过程切除的甲状腺组织。RTPCR试剂盒购自美国Promega公司。PCR产物纯化试剂盒、质粒提取试剂盒、凝胶纯化试剂盒购于上海博亚生物技术公司。pMD18T载体、限制性内切酶EcoRⅠ、BamHⅠ及DNA连接试剂盒购自TaKaRa公司。真核表达载体pcDNA3.1(+)、RNA提取Trizol试剂盒、阳离子脂质体Lipofectin Reagent 2000、细胞培养液、抗生素G418购自Invitrogen公司。鼠抗人TSHR单克隆抗体、Actin抗体购自ABCAM公司。免疫细胞化学染色试剂盒购自美国Vector公司。Western blot用BIORAD电转膜仪。中国仓鼠卵细胞(Chinese hamster oocyte, CHO)由第四军医大学生物技术中心提供。RTPCR检测hETSHR mRNA在CHO细胞表达所用的上游引物为：5′CCATCAGGAGGAGGACTTCAGAGTCACC3′;下游引物5′CAGTGGCTTGGGTAAGAAAGGTCAGCCC3′。内参照(βactin)购于北京鼎国生物技术有限公司。上游引物为：5′CATCTCTTGCTCGAAGTCCA3′;下游引物为：5′ATCATGTTTGAGACCTTCAACA3′。

　　1.2 pcDNA3.1(+)/hETSHR表达载体的构建和鉴定 人TSHR胞外段(human TSHR ectodomain gene, hETSHR)表达质粒构建的详细步骤参阅文献[2]，简述如下：取甲状腺组织100mg，总RNA的提取采用Trizol试剂，按照试剂盒步骤操作。RTPCR扩增获得目的基因 PCR产物经纯化后与pMD18T载体连接，转化感受态大肠杆菌DH5α，利用氨苄青霉素抗性筛选出阳性克隆，经测序后证明序列正确的阳性克隆子大量扩增后，以EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切质粒pMD18ThETSHR，获得含人促甲状腺激素受体膜外区(hETSHR)cDNA，长度约1254bp，并以低熔点琼脂糖回收纯化，同时pcDNA3.1(+)也经上述两种内切酶酶切，回收5.4kb大片段，将两者经T4DNA连接酶于16℃连接过夜，以连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α，氨苄青霉素筛选，提取质粒并再次测序鉴定。

　　1.3 阳离子脂质体转染细胞 复苏CHO细胞，按常规方法用含10mL/L FBS的DMEM培养。实验前24h，胰酶消化收集细胞，以2.5×105/孔接种于6孔板中，待细胞汇合率达80%时进行转染。分别提取pcDNA3.1(+)空载体质粒和pcDNA3.1/hETSHR，经分光光度计和电泳检测，A260/A280>1.9，且无任何降解的质粒用于转染。分别取上述制备好的质粒1.5μg，加入无血清的DMEM培养基中，总体积为100μL，混匀，于室温静置40min。6μL脂质体加入无血清、无抗生素的DMEM培养基至100μL，两者再混匀后，室温静置15min，不时轻轻摇匀。将细胞用无血清DMEM洗3次，每孔加入800μL的DMEM，然后逐滴加入上述置备好的200μL脂质体和DNA复合物，于37℃、50mL/L CO2培养4h。同时留1孔细胞不加质粒作为空白对照。弃去转染液，换用含50mL/L血清，500g/L G418的DMEM培养液2mL继续孵育72h，PBS洗涤收集细胞，完成表达产物的鉴定。

　　1.4 RTPCR检测hETSHR mRNA的表达 取转染后收集的CHO细胞，用Trizol提取细胞总RNA;核酸定量分析仪检测A260/A280及RNA含量。逆转录反应(RT)：反应体系中加入提取的总RNA(1μg)、Oligo(dT) 1μL、dNTP 2μL加DEPC水至12μL，放置于70℃水浴中5min，然后置于冰上。将4μL cDNA合成缓冲液、1μL DTT、1μL RNaseOUT(40u/mL)、1μL DEPC水和1μL AMV反转录酶混合(共8μL)，再加入上述12μL反应体系中，并充分混合，42℃孵育60min;70℃孵育10min终止反应即可得到cDNA。cDNA产物可以于-20℃保存或立即进行PCR反应。建立50μL的反应体系，分别加入10×PCR反应缓冲液5μL、dNTP 4μL、上、下游引物(引物S3、A3)各1μL、cDNA产物2μL、Taq DNA聚合酶1μL和水36μL。然后进行PCR反应，94℃预变性3min后，按下列参数循环30次：94℃变性1min，55℃退火30s，72℃延伸1min，最后一个循环72℃延伸15min。

　　1.5 hETSHR表达的免疫细胞化学检测 先在6孔板的底部，放入清洁无菌的载玻片，接种细胞使之爬片生长，待布满80%后按以上方法进行转染。转染48h后，取出载玻片，用PBS(0.1mol/L pH 7.4)洗涤3次，4℃的冷丙酮固定10min。PBS再洗3次，加入100mL/L小牛血清，室温封闭30min，吸掉封闭液。滴加鼠抗人hTSHR mAb，37℃孵育60min，以PBS洗3次，滴加异硫氰酸荧光素(FITC)标记山羊抗鼠二抗，37℃孵育60min，用PBS洗3次后，甘油封片，于荧光显微镜下观察并照相。

　　1.6 hETSHR表达的Western blot鉴定 将收集之细胞加入细胞裂解液，常规方法处理后，测定蛋白浓度，进行SDSPAGE电泳，结束后拆下凝胶，按BIORAD说明，将凝胶靠近阴极一侧，硝酸纤维素(NC)膜靠近阳极，在预冷的转移缓冲液中100V恒压1h电泳，将蛋白转移至NC膜上。电泳结束后，取出NC膜，TBST清洗后加入含4mL/L的BSA封闭液，4℃过夜。TBST洗涤3次，每次10min，加入鼠抗人hTSHR mAb(1∶1000稀释)，37℃孵育2h，洗涤3次后滴加HRP标记山羊抗鼠二抗，37℃孵育60min，TBST和TBS各自洗涤3次。加入ECL显色液，室温避光显色，曝光于X线底片适当时间，常规洗片机洗片。

　　2 结 果

　　2.1 hETSHR cDNA的获得及表达重组子的鉴定

　　以人甲状腺组织总RNA为模板，两条特异性引物扩增出长度为1254bp的TSHR膜外区片段;pMD/ETSHR重组子测序结果显示，插入序列中包含GenBank检索到人甲状腺TSH受体膜外区hETSHR cDNA全部序列，且碱基序列完全一致;构建的pcDNA3.1/ETSHR表达载体经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后，电泳结果显示与预期的TSHR膜外区片段大小相符。同时，以该表达载体为模板，PCR特异性扩增出TSHR膜外区片段(图1)。再次测序结果显示，插入序列无错义突变，且插入方向无误。

　　图1 pMD18T/hETSHR质粒和pcDNA3.1/hETSHR质粒酶切和PCR鉴定

　　Fig.1 Endonuclease digestion and PCR amplifying analysis of pMD18T/hETSHR and pcDNA3.1/hETSHR

　　1：pMD18T/hETSHR重组质粒用BamHⅠ和EcoRⅠ酶切;2：pcDNA3.1(+)/hETSHR重组质粒用BamHⅠ和EcoRⅠ酶切;3：pcDNA3.1(+)空质粒;4：PCR鉴定pcDNA3.1(+)/hETSHR重组子;M：DNA分子量标准。

　　2.2 转染细胞中hETSHR mRNA表达的RTPCR检测 以设计hETSHR基因特异性引物进行RTPCR检测，重组质粒pcDNA3.1/hETSHR转染细胞组在756bp处出现一条特异性的扩增带，与预期的基因片段大小相符;而空载体pcDNA3.1(+)转染组和未经任何处理的细胞组都无此条带(图2),说明前述RTPCR产物源于重组质粒转录后的mRNA。

　　图2 转染细胞中hETSHR mRNA表达的RTPCR检测

　　Fig.2 RTPCR analysis of hETSHR mRNA in transfected cells

　　1：CHO细胞无转染阴性对照;2：CHO细胞pcDNA3.1(+)空载体转染;3：重组质粒pcDNA3.1/hETSHR转染CHO细胞;M：DNA分子量标准。

　　2.3 免疫细胞化学检测hETSHR基因的表达 细胞免疫化学染色显示，转染空载体和未经转染的细胞都没有着染，而转染pcDNA3.1(+)/hETSHR的CHO细胞胞浆、胞膜有明显着染(图3)，说明目的蛋白在CHO细胞中得到表达。

　　图3 hETSHR基因表达的免疫细胞化学检测

　　Fig.3 Detection of hETSHR protein by immunocytochemical staining

　　A：重组质粒pcDNA3.1/hETSHR转染CHO细胞;B：CHO细胞pcDNA3.1(+)空载体转染。

　　2.4 Western blot结果 转染pcDNA3.1/hETSHR的细胞裂解液出现蛋白分子质量约50ku特异性条带，而相应转染pcDNA3.1(+)空质粒的细胞裂解液、培养细胞上清只有非特异性的弥散着色，说明pcDNA3.1/hETSHR在CHO细胞表达，表达蛋白能与人TSHR抗体发生特异反应，与单抗有特异结合能力(图4)。本实验Western blot结果和免疫细胞化学染色表明，CHO细胞中所存在的TSHR膜外区蛋白呈非分泌状态，这与RAPOPORT等[3]研究结果一致。

　　3 讨 论

　　由于存在于甲状腺TSHR数量少，结构不稳定，且难以纯化，临床及基础研究必需建立有效的体外表达系统。国内外及本室较早的一些研究表明[25]，原核表达系统产生的TSHR重组蛋白未被糖基化、不能形成正确的空间折叠，影响蛋白活性;而用真核表达载体表达重组蛋白能较好的保持原有的空间结构，被广泛应用于TSHR结构功能的研究。TSHR为7次穿膜受体，表达全长蛋白不易提取纯化到一定数量。TSHR膜外区有418个氨基酸残基,是与TSH和TSHR自身抗体结合的重要部位，主要的B细胞和T细胞抗原决定簇、TSHR自身抗体(TRAb)作用位点均位于其细胞膜外区[67]，因而国外学者用体外重组得到的TSHR膜外区纯化蛋白，可成功诱导甲亢动物模型[8]。在国内，有文献提及原核表达载体的构建[5]，而涉及TSHR体外真核表达系统的研究较少，仅有一篇报道从国外惠赠载体中得到TSHR基因片段，重新构建了真核表达载体[9]，且蛋白表达丰度如何未见报道。本研究是从人甲状腺组织中提取RNA，通过逆转录获得人TSHR膜外区cDNA，构建了TSHR膜外区真核表达载体，在哺乳动物工程细胞CHO中获得了高效表达蛋白，从而为合成短肽及实验研究提供了有力工具。

　　AITD特异性自身抗体的检测对疾病诊断具有重要意义，用重组的TSHR表达于体外细胞，可用于测定TSAb、TSBAb[10]。伴随免疫学及分子生物学技术的应用，以重组蛋白或多肽作为抗原，应用Western blot或ELISA检测特异抗体，在临床上具有广阔的应用前景;并可利用重组蛋白研究发病机制和建立AITD动物模型;还可根据不同临床需要，结合精确的蛋白质芯片技术，为开发多种自身抗原联合检测相应的自身抗体试剂盒奠定了基础。

　　【参考文献】

　　[1]KOPP P. The TSH receptor and its role in thyroid disease [J]. Cell Mol Life Sci, 2001(58):13011322.

　　[2]武敏，施秉银，伍丽萍，等. 人TSHR膜外区cDNA克隆及真核表达载体的构建 [J]. 西安交通大学学报：医学版, 2007, 28(02):123125.

　　[3]RAPOPORT B, MCLACHLAN SM, KAKINUMA A, et al. Critical relationship between autoantibody recognition and thyrotropin receptor maturation as reflected in the acquisition of complex carbohydrate [J]. J Clin Endocrinol Metab, 1996, 81(7):25252533.

　　[4]魏枫，雒文田，吕晓红，等. TSHR蛋白表达质粒的构建和TSHR蛋白的表达 [J]. 中国免疫学杂志, 2000, 16(10):529532.

　　[5]吴晓燕，雒文田，徐利，等. 人TSH受体胞外段高效表达质粒的构建、表达及蛋白纯化[J]. 中华内分泌代谢杂志, 2004, 20(5):470471.

　　[6]CHEN CR, MCLACHLAN SM, RAPOPORT B. Identification of key amino acid residues in a thyrotropin receptor monoclonal antibody epitope provides insight into it's inverse agonist and antagonist properties [J]. Endocrinology, 2008, 149(7):34273434.

　　[7]CHAZENBALK GD, PICHURIN P, CHEN CR, et al. Thyroid stimulating autoantibodies in Graves disease preferentially recognize the free A subunit,not the thyrotropin holoreceptor [J]. J Clin Invest, 2002, 110(2):209217.

　　[8]NAGAYAMA Y. Graves animal models of Graves hyperthyroidism [J]. Thyroid, 2007, 17(10):981988.

　　[9]詹升华，张徽，刘纯. pcDNA3.1/hTSHR真核表达载体的构建及其在COS7细胞中的表达 [J]. 细胞与分子免疫学杂志, 2004, 20(4):390393.

　　[10]SCHOTT M, ECKSTEIN A, WILLENBERG HS, et al. Improved prediction of relapse of Graves thyrotoxicosis by combined determination of TSH receptor and thyroperoxidase antibodies [J]. Horm Metab Res, 2007, 39(1):5661.