hURAT1基因5’UTR区荧光素酶表达重组体的构建

　　作者：刘贤贤,李长贵,王瑶,吕森森 刘贤贤(1984)，女，硕士研究生。 作者单位：(青岛大学医学院附属医院内分泌科，山东 青岛 266003)

　　【摘要】 目的 构建人尿酸盐转运蛋白1(hURAT1)基因5’UTR区荧光素酶表达重组体。方法 PCR扩增包含hURAT1基因启动子最小功能单位和5’UTR区域在内的DNA片段，克隆至荧光素酶表达载体pGL3basic，构建hURAT1 5’UTR区表达重组体。重组体经双酶切后测序进行鉴定。结果 克隆获得的590 bp的DNA序列与GenBank报道的一致，且插入方向正确。结论 成功构建了含hURAT1基因5’UTR区的荧光素酶表达载体，可用于后续功能研究。

　　【关键词】 人尿酸盐转运蛋白1;荧光素酶;高尿酸血症

　　CONSTRUCTION OF THE LUCIFERASE EXPRESSION RECOMBINANT CONTAINING hURAT1 IN 5’UTR REGION

　　LIU XIANXIAN, LI CHANGGUI, WANG YAO, et al

　　(Department of Endocrinology, The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266003, China);

　　[ABSTRACT] Objective To construct the luciferase expression recombinant containing human urate transporter 1 gene (hURAT1) in 5’untranslated region (5’UTR). Methods The smallest functional unit of hURAT1 gene promoter and DNA segments in 5’UTR were amplified with the human genome DNA by PCR, the segment was cloned into the luciferase expression vector pGL3basic. The recombinant was detected by endonuclease and sequenced. Results The sequenced segment (590 bp)obtained in the recombinants was identical to that reported by GenBank and the segment inserted in the correct direction. Conclusion The luciferase expression recombinant containing hURAT1 in 5’UTR is successfully constructed, which can be used for subsequent function research.

　　[KEY WORDS] human urate transport protein 1; luciferase; hyperuricaemia

　　原发性高尿酸血症及痛风为一种常见病和多发病。研究已经证实，90%以上原发性高尿酸血症是因肾脏对尿酸的排泄减少所致[12]，人近曲小管上皮细胞膜上多个转运蛋白参与了肾脏对尿酸的排泄，其中人尿酸盐转运子1 (hURAT1) 是维持血尿酸水平的关键离子通道，是原发性高尿酸血症和痛风的重要候选基因[34]。hURAT1基因位于11q13区，其含有10个外显子和9个内含子，cDNA全长为2 642 bp，编码区长为1 659 bp，编码555个氨基酸[5]。5’UTR为连接第一外显子和启动子区的非编码序列，该区域在基因转录和翻译过程中发挥重要的调控作用，其SNP可明显影响启动子活性，影响基因表达。hURAT1 mRNA主要在人肾小管上皮细胞中特异性表达，临床上得到含有待研究SNP位点肾脏标本的概率很小，所以体外重组体的成功构建成为研究hURAT1基因突变或SNP影响基因启动子活性及其表达的主要手段。本文通过PCR技术扩增hURAT1基因启动子最小功能单位和5’UTR区域在内的DNA片段，克隆到真核表达载体pGL3basic中，构建pGL3basic/hURAT1 5’UTR 重组体，为今后研究该段区域基因变异对表达的影响奠定基础。

　　1 材料和方法

　　1.1 实验材料

　　主要实验材料包括：基因组DNA提取试剂盒(TAKARA)、KOD DNA聚合酶(TOYABO)、QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN)、pGEMT Easy Vector(PROMEGA)、T4 DNA 连接酶(PROMEGA)、胰蛋白胨、酵母提取物、琼脂、氨苄青霉素(SANGON)、限制性内切酶(FERMENTAS)、pGL3basic vector(INVITROGEN)、DH5α感受态细胞(TIANGEN)、质粒小规模抽提试剂盒(AXYGEN)。 仪器：PTC225型高通量PCR仪(MJR)、UVP凝胶成像仪(BIORAD)、MIR 262 恒温孵箱(SANYO)、低温离心机(EPPENDORF)、BioRAD 电泳仪、DU650型紫线外分光光度计(EPPENDORF)、超净工作台(ClassBiological Safety CabinetⅡ，BAKER Company)。

　　1.2 实验方法

　　1.2.1 引物及其合成

　　根据hURT1基因5’UTR区590 bp DNA序列(-253～+337 GenBank uc001oam.1)设计特异性引物，5′端分别加入KpnⅠ、BglⅡ酶切位点，上游引物为PF：5′GGGGTACCTTGGCTCAGCCACTCTG3′，下游引物为 PR：5′GAAGATCTGGAACCTACTCAAGGGGC3′，由上海生工生物技术有限公司合成。

　　1.2.2 基因组DNA的提取

　　用酚氯仿抽提外周血基因组DNA，作为PCR扩增的模板。

　　1.2.3 PCR扩增

　　用PF和PR引物，PCR扩增hURAT1基因启动子最小功能单位和5’UTR区在内的DNA片段(图1)。PCR反应参数：95 ℃ 预变性5 min;94 ℃ 变性30 s，62 ℃ 退火40 s，72 ℃ 延伸40 s，进行35个循环;72 ℃延伸10 min。15 g/L琼脂糖凝胶电泳分离，紫外线凝胶检测仪检测结果。PCR产物用DNA纯化试剂盒进行回收,定量，分装，-20 ℃贮存。

　　1.2.4 pGEMT Easy Vector/ hURAT1 5’UTR重组体的构建

　　①连接：4 ℃将扩增片段与pGEMT Easy Vector按照摩尔比(3～8)∶1连接12 h。②转化：将上述连接反应产物5 μL加入50 μL DH5α感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30 min;42 ℃热休克90 s;立即置入冰浴中3 min;加入2×YT培养基900 μL，37 ℃水平振摇(150 r/min)培养45 min;加入20 g/L Xgal 40 μL、1 mol/L IPTG 10 μL,取适量的上述转化菌液涂布于预热的2×YT培养板(含氨苄青霉素100 mg/L)，37 ℃水平倒置培养过夜。③蓝白斑筛选克隆：挑取一些独立的白色的转化菌落进行小规模培养，用挑菌环挑取白色单菌落于4 mL含氨苄青霉素(100 mg/L)的2×YT液体培养基中，于37 ℃条件下250 r/min振摇培养12～14 h。以质粒小规模抽提试剂盒从4 mL菌液提取质粒。④重组体鉴定：限制性内切酶 EcoR Ⅰ酶切提取的质粒，以琼脂糖凝胶电泳，紫外线凝胶检测仪检测结果。

　　1.2.5 pGL3basic/hURAT1 5’UTR重组体构建

　　①酶切：pGL3basic和酶切鉴定正确的pGEMT Easy Vector/ hURAT1 5’UTR重组体均采用KpnⅠ和BglⅡ进行双酶切，回收pGL3basic和hURAT1 5’UTR片段，割胶纯化定量。②连接：16 ℃条件下采用T4 DNA连接酶将pGL3basic片段与hURAT1 5’UTR 片段按照摩尔比(3～8)∶1连接过夜。③转化：即将上述连接产物转化到DH5α感受态细胞中，步骤同上。④蓝白斑筛选克隆：用挑菌环挑取白色单菌落于4 mL含氨苄青霉素(100 mg/L)的2×YT液体培养基中，于37 ℃条件下250 r/min振摇培养12～14 h。⑤质粒抽提：质粒小规模抽提试剂盒(AXYGEN)抽提质粒。⑥重组体鉴定：限制性内切酶KpnⅠ和BglⅡ双酶切提取的质粒，以琼脂糖凝胶电泳,紫外线凝胶检测仪检测结果，然后将酶切鉴定正确的质粒进行测序鉴定，酶切验证正确的重组质粒由上海申速技术有限公司测序。

　　2 结果

　　2.1 PCR产物的鉴定

　　本文利用PCR技术扩增hURAT1基因启动子最小功能单位和5’UTR区590 bp的DNA序列(-253 bp～+337 bp)，PCR产物的全长为590 bp，琼脂糖凝胶电泳显示PCR产物片段大小符合(图2)。

　　2.2 重组质粒的酶切鉴定

　　重组质粒经KpnⅠ和BglⅡ联合消化，被切成长4 816 bp和592 bp两个片段(图3)。 酶切反应的结果与预期的相符。

　　2.3 pGL3basic重组质粒的测序鉴定

　　经测序，重组质粒与GenBank报道一致，插入方向正确，证明目的基因已成功转入pGL3basic载体中。

　　3 讨论

　　原发性高尿酸血症是一组与遗传有关的由于嘌呤代谢紊乱和(或)尿酸排泄障碍所致的异质性疾病，该病既是痛风的早期阶段，又是痛风发生、发展的必要条件。其进一步发展可引起急性关节炎反复发作，并表现出痛风石、关节强直或畸形、肾实质损害、尿路结石等多种慢性症状[6]。目前研究表明，90%原发性高尿酸血症的发病是肾脏对尿酸的排泄减少所致，其中发挥主要作用的是肾小管对尿酸的重吸收增加。在多个近曲肾小管上皮细胞膜上的尿酸转运离子通道中，hURAT1活性增加起了关键作用。hURAT1为阴离子交换通道，由12个跨膜结构域组成，通过与乳酸等有机阴离子及氯等无机离子交换，将肾小管管腔内尿酸等转运到肾小管上皮细胞内[7]。hURAT1 mRNA主要在人肾小管上皮细胞中特异性表达，位于肾近端小管上皮细胞管腔侧，是尿酸从肾近端小管重吸收主要离子通道[8]。

　　5’UTR区为连接第一外显子和启动子区的非编码序列，该区域在基因转录和翻译过程中发挥重要调控作用。①保护mRNA，防止RNA酶的5′→ 3′外切酶活性对mRNA的降解;②增强mRNA的剪切和翻译效率;③影响翻译起始的准确性。研究结果显示，hURAT1基因5’侧翼区是一段高度保守性序列，大鼠和小鼠与人类的同源性分别为80%和79%[910]。2004年LI[9]等应用双荧光素酶报告基因系统对5′侧翼区进行功能检测，发现-599～-856为沉默子区域，-599～-253为增强子区域，-253～+83是最小启动子功能区域。目前发现的hURAT基因突变或SNP大部分位于基因外显子和内含子区，在启动子区和5’ UTR罕见。文献报道，该区SNP可明显影响启动子活性，影响基因表达。有研究结果显示，骨关节炎的易感基因(GDF5基因) 5’UTR的一个SNP可明显降低GDF5启动子的转录活性，使体内GDF5基因表达明显下降，说明5’UTR的单个位点SNP可影响启动子活性，这为5’UTR调节基因表达提供了直接证据。

　　本文PCR扩增包含hURAT1基因启动子最小功能单位和5’UTR区域在内的DNA片段，克隆至荧光素酶表达载体pGL3basic，构建正常人pGL3basic/hURAT1 5’UTR 重组体。构建的正常人重组体可用于hURAT1基因5’UTR区的体外功能研究，即将重组体转染入肾近端小管上皮细胞，通过双荧光素酶报告基因系统来检测启动子区活性;也可根据对正常对照组人群和高尿酸及痛风组人群基因筛查出的SNP或突变位点，应用定点突变技术改变正常人重组体该位点的碱基，为今后研究该段区域基因变异对表达的影响奠定基础，进一步探究原发性高尿酸血症和痛风的分子机制，对原发性高尿酸血症及其相关疾病的早期防治和新药开发具有重要意义。

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