肾炎宁对LPS诱导人肾小球系膜细胞增殖及细胞外信号调节蛋白激酶的影响

作者：王月华 边东 范焕芳 郭登洲 袁国栋 王月华(1973)，女，博士，副主任医师，主要从事中西医结合肾脏疾病的临床与基础研究。    作者单位：河北医科大学中医院，河北 石家庄 050017 河北省科技攻关计划项目（No.00276205D） 　1 河北医科大学 　　【摘要】  目的 探讨肾炎宁对人肾小球系膜细胞(HMC)细胞增殖及细胞外信号调节蛋白激酶(extracellular signalregulated protein kinase,ERK)的影响。方法 应用细胞培养技术，进行HMC培养，采取血清药理学方法，制备肾炎宁药物血清，利用脂多糖(LPS)为刺激因子，应用四唑盐（MTT）比色法和酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞的增殖和磷酸化ERK1/2的表达。结果 肾炎宁可显著抑制HMC增殖，抑制率在12、24和48 h分别为16.0%、15.4%、18.2%，LPS组磷酸化ERK1/2的含量与空白组比较明显升高(P<0.05)；中药组与空白组比较，磷酸化ERK1/2含量明显降低(P<0.05)；LPS+肾炎宁组与LPS组比较，磷酸化ERK1/2表达明显降低 (P<0.05)。结论 肾炎宁具有抑制正常培养条件及LPS刺激条件下磷酸化ERK1/2，从而发挥对肾小球硬化的治疗作用。

　　【关键词】  肾炎宁；系膜细胞培养；增殖；细胞外信号调节蛋白激酶

　　The effect of Shenyanning on expression of extracellular signalregulated protein kinase of human mesangial cells

　　WANG YueHua，BIAN Dong，FAN HuanFang，et al.

　　Traditional Medicine College of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050017，Hebei，China

　　【Abstract】Objective  To investigate the effect of Shenyanning on the expression of extracellular signalregulated protein kinase of human mesangial cells(HMCs).Methods  HMCs were cultured by applying cell cultural technique.The serum pharmacological method was used in the preparation of shenyanning serum.HMC proliferation was detected by MTT.The pERK1/2 expression was detected by enzymelinked immunosorbentassay (ELISA) taking lipopolysaccharide (LPS) as stimulating factor.Results  Shenyanning significantly inhibited HMC proliferation；and the inhibition ratios of medium dose were 16.0%，15.4% and 18.2%   when HMC were cultured for 12，24 and 48 h.The content of pERK1/2 in LPS group was obviously higher than that in blank group(P<0.01)，that in shenyanning group was obviously lower than that in blank group(P<0.05).The expression of pERK1/2 in LPS combined Shenyanning group was obviously lower than that in LPS group(P<0.01).Conclusions  Shenyanning could inhibit the expression of pERK1/2 in the condition of normal or LPS stimulation，which may be the mechanism of Shenyanning in the delay of glomerularsclerosis.　　【Key words】  Shenyanning；Mesangial cell culture；Proiferation；Extracellular signalregulated protein kinase

　　IgA肾病是目前最常见的原发性肾小球肾炎之一,15%～20%的患者在确诊后10年内、30%～35%的患者在确诊后20年内进入终末期肾衰竭(ESRF)〔1〕。本病特征为弥漫性肾小球系膜区免疫球蛋白沉积，并有肾小球系膜细胞(MC)增殖。MC分泌细胞因子及细胞外基质（ECM），参与肾小球炎症发展过程，促进肾小球硬化。抑制炎症状态下MC的增殖与分泌，在IgA肾病的治疗中有重要意义〔2〕。我们根据中医理论，探究本病病因病机，提出“益气养阴化瘀祛湿法”，并依法组方肾炎宁治疗IgA肾病，临床取得了较好的疗效〔3，4〕。鉴于此，本研究试图通过观察肾炎宁对人MC（HMC）细胞外信号调节蛋白激酶(extracellular signalregulated protein kinase,ERK)的影响，以探讨其临床药效及部分作用机制。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料

　　LPS(美国Sigma公司);Ⅳ型胶原酶、RPIM1640(均为Sigma公司产品)；ELISA试剂盒由美国Santa Cruz公司提供；肾炎宁(由黄芪、党参、茯苓、白术、女贞子、旱莲草、生地黄、白茅根、川芎、白花蛇舌草、三七粉、仙鹤草等组成)，由本院制剂室提供。

　　1.2 药物血清制备

　　选年龄、体重相近的成年健康志愿者2名。其中1名口服肾炎宁，每日2次；连续3 d。末次用药1 h后无菌取静脉血20 ml，分离血清，56℃ 30 min灭活处理后用0.22 μm微孔滤膜过滤，70℃冰箱保存备用。不服用药物的1名同时采血，分离血清备用。

　　1.3  系膜细胞的培养及鉴定

　　HMC取自5月大的引产胎肾，由河北医科大学附属医院提供，迅速无菌取其肾脏，剥除肾包膜，将肾皮质剪成碎屑，研磨依次通过80、140、220目筛网，收集肾小球，Ⅳ型胶原酶消化7 min，接种于25 cm2培养瓶，培养液为含20% FCs、HEPES、青霉素、链霉素的RPMI1640液。5 d左右，肾小球贴壁，周围长出细胞，首次换液，以后每2天换液1次。当HMC长至80%融合时，用胰蛋白酶消化传代。亚培养的系膜细胞生长很快，2～3 d布满瓶底，可冻存备用，经形态学鉴定为MCs，取4～5代细胞为实验所用。

　　1.4  采用四唑盐(MTT)比色法检测细胞增殖

　　MCs以1×104/孔接种于96孔板内，24 h后换成含1%胎牛血清的培养液孵育24 h，使细胞同步于静止期，弃上清；96孔板从左至右依次分为空白对照组(简称空白组，加入5%正常人血清)、肾炎宁组(加入5%肾炎宁药物血清)、脂多糖(LPS)组(加入LPS10 g/L和5%正常血清)、LPS+肾炎宁组(加入LPS 10 g/L和5%肾炎宁药物血清)共4个组，每组设有6个复孔。各组均加入含胎牛血清的RPMI1640培养液,使血清终浓度为10%，每孔培养液总量为200 μl，37℃、5% CO2培养箱中孵育。分别于培养12、24和48 h时取出培养液，加入MTT 20 μl(5 mg/ml)，继续培养4 h，吸弃各孔培养液，加入100 μl DMSO，室温避光，轻轻震荡10 min，使结晶充分溶解后，酶标仪490 nm波长处读取OD值。

　　1.5  ELISA方法测定磷酸化ERK1/2的表达

　　HMC经上述方法同步化后，37℃、5% CO2培养箱中孵育48 h，准备指标检测。

　　1.6  统计学方法

　　采用SPSS13.0统计软件，计量资料以x±s表示，组间两两比较采用t检验法。

　　2  结果

    肾炎宁可显著抑制HMC增殖，抑制率在12、24和48 h分别为16.0%、15.4%、18.2%，LPS组磷酸化ERK1/2的含量与空白组比较明显升高(P<0.05)；中药组与空白组比较，磷酸化ERK1/2含量明显降低(P<0.05)；LPS+肾炎宁组与LPS组比较，磷酸化ERK1/2表达明显降低 (P<0.05)。见表1。表1  各组HMC细胞增殖及磷酸化ERK1/2的表达(略)

　　3  讨论

    IgA肾病发病率逐年递增，随着对IgA肾病研究的日益深入，已知其预后并不乐观。本病在中医内科中主要归属于“尿血”、“腰痛”、“水肿”范畴，多数患者起病隐匿。其发病与多种因素有关。但其基本病机是本虚标实。《金匮要略注》云：“五脏六腑之血，全赖脾气统摄”。脾有统摄血流在经脉中流行、防止溢出脉外的功能。脾的功能正常则血不会溢出脉外。反之，脾气亏虚、统血不力，即可导致尿血。肾气虚惫，失于封藏，也致尿血日久不愈，蛋白等精微物质从尿中流失。肾阴亏虚，阴虚火旺，灼伤脉络亦可见精微物质从尿中流失。脾虚不能运化水湿，肾虚不能化气行水，精微外泄而水液停滞，则见尿浊浮肿；病情继续发展，气血俱伤，脾肾失养，浊毒内停，三焦受阻，升降失常，水湿泛滥。“至虚之处，便是留邪之地”，病程日久，肾之络脉气阴两虚，气虚无力运血而致血瘀；阴虚火旺，煎熬津液，津亏液少则血液黏稠不畅而致阴虚血瘀，肾络瘀阻，致使肾体受损，肾用失司，导致本病的发生。总之，IgA肾病形成机制是非常复杂的。既有脾肾脏腑功能失调，致气阴两虚，又有湿浊瘀血作祟。鉴于此我们提出“益气养阴化瘀祛湿法”治疗本病，并依法组方肾炎宁，临床取得了较好的疗效〔3，4〕。方中黄芪益气固表，利水消肿，且黄芪大补宗气，使气旺血行。党参、茯苓、白术补中、健脾、益气，祛湿；白茅根、生地黄、女贞子、旱莲草养阴补肾、凉血止血；川芎活血行气；三七粉、仙鹤草活血止血。该方标本兼顾，虚实并重，确能切中病机。    　　MC属于肾小球毛细血管网周细胞，正常时不发生明显的增殖，但在炎症，免疫复合物等病理情况下则出现异常的增生〔5〕。MC的过度增殖，一方面突入肾小球毛细血管腔，导致管腔狭窄或闭塞；另一方面分泌大量ECM并且积聚在肾小球内，导致肾小球硬化，造成肾脏功能进行性损害〔6，7〕。因此，有效地抑制MC的增殖将会在很大程度上减缓肾小球硬化及慢性肾炎的进展。丝裂素活化蛋白激酶（mitogenactived protein kinase,MAPK）级联是真核介导细胞外信号到细胞内反应的重要信号传导系统，调节着机体细胞的生长、分化、分裂、死亡以及细胞间的功能同步等多种功能〔8〕。哺乳动中，MAPK包括5个亚类：即ERK、JNK、p38、ERK3/4、ERK5。ERK包括两个高度同源的亚类ERK1和2。胞外刺激可经G蛋白受体、生长因子受体和酪氨酸蛋白激酶受体，经RafMEKERK级联信号激活ERK,调节转录因子和一些激酶活性，促进细胞增殖，蛋白质合成〔9，10〕。因此，本研究选取磷酸化ERK1/2观察肾炎宁对系膜细胞增殖的影响。结果显示，肾炎宁可显著抑制HMC的增殖，抑制正常培养条件及LPS刺激条件下磷酸化ERK1/2，从而发挥对肾小球硬化的治疗作用。

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　　4 郭登洲,谢惠芬,王彦刚，等.肾炎宁治疗IgA肾病的临床研究〔J〕.中华实用中西医杂志，2003；3(16):2156.

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