雌激素诱发大鼠催乳素瘤的机制

　　作者：徐春 作者单位：100039 北京,武警总医院内分泌科

　　【摘要】 目的 通过分析雌激素对大鼠垂体Pit1基因表达的作用，探讨雌激素诱发大鼠催乳素瘤的发病机制。方法 成年雌性Wistar大鼠，去势手术后分2组：(1) 对照组(C组，n=16)皮下植入空白硅胶管;(2) 雌激素组(E组，n=16)：皮下植入含有乙稀雌酚的硅胶管。分别于用药第2、4、6、8周处死动物。垂体称重。用放免法测定大鼠血清PRL水平。用反转录PCR方法检测Pit1 mRNA在各组垂体组织中的表达量。结果 在用药第2、4、6、8周，大鼠血清PRL水平、垂体重量、垂体组织Pit1 mRNA水平均逐渐增高，垂体组织Pit1 mRNA水平与大鼠血清PRL水平和垂体重量均呈明显正相关(相关系数分别为0.946和0.913，P=0.01)。结论 雌激素刺激垂体组织表达Pit1基因， Pit1在雌激素诱发的大鼠PRL瘤的发生中起重要作用。

　　【关键词】 发病机制 大鼠 催乳素瘤 雌激素 Pit1

　　雌激素是垂体催乳素(PRL)细胞增生和PRL基因表达强有力的刺激因子,雌激素作用于垂体PRL细胞上的雌激素受体，雌激素雌激素受体复合物通过细胞内的一系列生物学效应引起PRL的分泌和PRL细胞的增生，最终形成PRL瘤。雌激素雌激素受体复合物通过何种途径或与何种因子共同作用导致PRL的分泌和PRL细胞的增生?最近研究发现，在PRL基因的近端启动子和远端增强子存在Pit1特异性的结合部位,PRL基因的正常表达需要Pit1蛋白与雌激素雌激素受体的协同作用[1，2]。本研究通过分析Pit1基因在雌激素诱发的大鼠PRL瘤中的表达,探讨雌激素对垂体PRL细胞的作用机制。

　　1材料与方法

　　1.1大鼠PRL瘤的制备

　　成年雌性Wistar大鼠，体重120～150g，腹腔内注射10%水合氯醛50～80mg/kg，大鼠完全麻醉后,常规消毒,于背部腰椎两侧做长约2～3cm的纵形切口,暴露腹腔,结扎子宫,切除卵巢,并逐层缝合。于其背部中线尾骨上约3cm偏左处作一约1cm长纵形口切，并游离皮下组织，随机将一含有乙稀雌酚20mg的硅胶管(长2cm,内径1.5mm,外径2.41mm)或空白硅胶管植入皮下。全部动物分2组：(1) 对照组(C组，n=16)皮下植入空白硅胶管;(2) 雌激素组(E组，n=16)：皮下植入含有乙稀雌酚的硅胶管。分别于用药第2、4、6、8周用乙醚麻醉大鼠，心脏穿刺取血分离血清于-70℃保存，打开颅骨，摘下垂体，称重后将一半冻于液氮中,一半放于4%多聚甲醛中固定。

　　1.2血清PRL水平的测定

　　大鼠血清PRL放免测定的抗原和抗体由National hormon and pltuitary program(NHPP)公司惠赠。用氯胺T法标记催乳素抗原,灵敏度为0.54ng/ml,批内CV为6.8%,批间CV为8.7%。

　　1.3垂体组织中Pit1 mRNA表达量的检测

　　1.3.1总RNA的提取 垂体组织15～30mg,用异硫氢酸胍一步法提取,RNA提取试剂盒(Trizol)购自GIBCORL公司。计算RNA含量(1 OD280=40μg/ml)。

　　1.3.2模板cDNA的合成 总RNA 2μg中加入OligdT 0.5μg,置于70℃预变性5min，然后在冰浴中,依次加入以下反应物:5×Buffer 4μl,10×dNTP 2μl,RNasin 20U(购自Promega公司),AMV 10U(购自Promega公司),反应总体系为20μl。于42℃ 1h,98℃ 5min灭活反转录酶，RT产物于-20℃保存。

　　1.3.3目的基因的扩增(PCR) Pit1基因的上游引物为5'CACCTCGGCTGATACCTTT3',下游引物为5'GTTTGCTCCCACTTTTTC3'[3],扩增产物为616bp。在25μl的反应体系中依次加入10×Buffer 2.5μl，2.5×dNTP 3μl,引物(上游和下游各)20pmol,逆转录产物0.5～3μl和无菌去离子水,混匀,加液体石腊油覆盖,进行PCR扩增反应。98℃ 10min预变性后在88℃下 加Taq酶(1U/管)，以βactin做内对照，上游引物为5'CGTTGACATCCGTAAAGA3'，下游引物为5'AGCCACCAATCCACACAG3'。于94℃变性 1min，56℃退火1min，72℃延伸1.5min。

　　1.3.4PCR产物的检测 制备1.5%的琼脂糖凝胶,含溴化乙啶0.5μg/ml,PCR产物与载体缓冲液比例为6∶1,在70V恒压电泳20min,于UVP计算机图像分析系统测定样本灰度值,以βactin作为内参照,计算相对含量。

　　1.3.5统计学分析 所有实验数据以均数±标准差表示,用SPSS统计软件分析，两组间差异用t检验，多组间差异用方差分析，用回归分析方法判断两因素之间是否存在相关性。

　　2结果

　　见图1。

　　2.1大鼠垂体重量的比较

　　在用药2、4、6、8周，C组大鼠垂体重量分别为(14.2±1.8)mg、(15.7±1.7)mg、(14.4±2.0)mg和(13.0±1.6)mg,无明显差别(F=1.61,P=0.239);E组垂体重量分别为(21.5±3.2)mg、(30.6±3.1)、(45.5±8.7)mg、(74.1±8.4)mg呈逐渐增加的趋势，有统计学差别(F=53.055,P<0.001)。在用药2、4、6、8周，E组垂体重量均分别高于C组,具有统计学差别，t值分别为5.934、8.381、6.997和14.225，P值分别为0.001、<0.001、<0.001和<0.001。

　　2.2大鼠血清PRL水平的比较

　　在用药2、4、6、8周，C组大鼠血清PRL水平分别为(18.3±5.1)μg/L、(23.6±7.0)μg/L、(22.4±4.5)μg/L、(25.9±8.8)μg/L 无明显差别(F=0.939，P<0.001);E组血清PRL水平分别为(152.4±65.1)μg/L、(791.9±124.1)μg/L、(2235.9±229.0)μg/L、(4622.8±712.6)μg/L，呈逐渐增加的趋势，有统计学差别(F=108.518，P<0.001)。E组大鼠血清PRL水平均分别高于C组,有统计学差别，t值分别为4.109、12.363、19.382和12.901，P值分别为0.006、<0.001、<0.001和<0.001。

　　2.3Pit1 mRNA在垂体组织中表达水平的比较

　　用2%琼脂糖凝胶电泳检测RTPCR产物,以大鼠脂肪组织做阴性对照，E组和C组标本在616bp处均有清晰的带型，说明Pit1 mRNA在两组大鼠垂体组织中均有表达,见图2。

　　在用药2、4、6、8周，C组大鼠垂体组织Pit1 mRNA水平分别为0.8±0.4、1.0±0.4、1.2±0.4、(血清PRL水平、垂体重量以及垂体组织Pit1 mRNA水平) 0.8±0.4，无明显差别(F=0.870，P=0.484)。E组Pit1 mRNA水平分别为1.4±0.4、2.6±0.1、3.4±0.2、5.5±0.4，呈逐渐增加的趋势，具有统计学差别(F=123.850，P<0.001)。在用药2、4、6、8周，E组Pit1 mRNA水平均分别高于C组，具有统计学差别，t值分别为2.504、7.735、10.371和16.726，P值分别为0.046、<0.001、<0.001和<0.001。

　　2.4Pit1 mRNA水平与血清PRL值的关系

　　E组大鼠垂体组织Pit1 mRNA水平与大鼠血清PRL值呈正相关，相关系数为0.964(P=0.01)。

　　2.5Pit1 mRNA水平与大鼠垂体重量的关系

　　E组大鼠垂体组织Pit1 mRNA水平与垂体重量呈明显正相关，相关系数为0.913(P=0.01)。

　　3讨论

　　Pit1蛋白是POU ( Pit1,Oct1，Oct2 and Unc86的缩写)家族的成员之一，是垂体特异的转录因子。对垂体生长激素(GH)细胞、PRL细胞以及促甲状腺素(TSH)细胞的发育、分化和增生均有重要的调节作用[4，5]。有报道Pit1基因在人垂体PRL瘤和GH瘤中的表达量明显增高,提示Pit1对人垂体GH和PRL腺瘤细胞分化和增生具有一定的作用[6]。本研究发现，在雌激素诱发大鼠PRL瘤的过程中，大鼠垂体组织Pit1 mRNA水平逐渐增高，Pit1的表达量分别与大鼠血清PRL水平和垂体重量呈明显的正相关,提示Pit1与大鼠垂体PRL基因的表达和PRL细胞的增生密切相关。

　　Pit1的表达受性激素的调节。雄性大鼠去势后,垂体组织的Pit1 mRNA水平明显下降,补充生理剂量睾酮可以阻止其下降[7]。本研究用去势的雌性大鼠为研究对象,在雌激素的作用下，垂体PRL瘤组织Pit1基因的表达量逐渐升高,说明雌激素刺激垂体组织Pit1基因的表达。体外培养研究发现，雌激素直接刺激Pit1 mRNA的表达,双氢睾酮(DHT)则不具备这一作用,提示雌激素直接作用于垂体影响Pit1基因的表达。

　　有学者分析Pit1基因和雌激素受体基因在人PRL瘤中的表达，发现80%的PRL瘤表达Pit1基因，94%的PRL瘤表达雌激素受体基因，其表达局限于PRL细胞中，提示Pit1和雌激素受体在PRL瘤的分化和发展中起协同作用[8]。在雌激素诱发大鼠PRL瘤的发生和发展中同样需要雌激素受体和Pit1的共同作用。我们曾研究发现雌激素受体在雌激素诱发的大鼠PRL瘤中的表达明显增高[9]，本研究结果显示Pit1在雌激素诱发的大鼠PRL瘤中的表达明显增高，这些结果提示，雌激素刺激垂体组织表达雌激素受体以及Pit1基因是雌激素诱发大鼠高PRL血症的机制之一。

　　结论: 雌激素刺激垂体组织表达Pit1基因,Pit1在PRL基因的表达和PRL细胞的增生中起重要作用。

　　【参考文献】

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