缬沙坦对糖尿病大鼠心肌血小板源生长因子B的表达及心肌纤维化的影响

　　作者：赖鹏斌 张蕾 杨立勇 作者单位：福建医科大学附属漳州市医院内分泌科，福建 漳州 363101

　　【摘要】 目的 探讨缬沙坦对糖尿病(DM)大鼠心肌血小板源生长因子B(PDGFB)表达及心肌纤维化的影响。方法 32只大鼠分为对照组、DM未治疗组、 缬沙坦小剂量治疗组(10 mg·kg-1·d-1)、缬沙坦大剂量治疗组(30 mg·kg-1·d1);12 w后放免法测定血浆和心肌血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)浓度;称量体重及全心、左室重量，计算心体比(H/B)和左室重量指数(LVMI);天狼星红染色测量心肌间质的胶原容积分数(CVF)。 RTPCR检测各组心肌PDGFB、纤维连接蛋白(FN)、Ⅲ型胶原(ColⅢ)的mRNA表达情况。结果 DM未治疗组H/B、LVMI增高(P<0.01);PDGFB、FN和ColⅢ mRNA表达显著上调;缬沙坦干预12 w后，血浆和心肌 AngⅡ浓度升高;H/B、LVMI降低(P<0.05或P<0.01)，DM心肌中FN、ColⅢ mRNA的表达减少，心肌间质CVF降低(均P<0.01);大小剂量治疗组可以减少DM心肌PDGFB mRNA的表达(P<0.01)。以上效应具有剂量依赖性。结论 DM大鼠心肌PDGFB表达明显上调。缬沙坦能减少DM大鼠心肌细胞外基质(ECM)积聚，改善心肌结构，PDGFB表达下调可能是缬沙坦抑制DM心肌纤维化的心脏保护作用机制之一。

　　【关键词】 缬沙坦;糖尿病;大鼠;心肌病变;血小板源生长因子B

　　1 福建医科大学附属第一医院内分泌科

　　心肌纤维化是糖尿病心肌病(DC)重要的病理改变，是糖尿病(DM)心脏舒张功能障碍进而发生充血性心力衰竭的主要原因之一〔1〕。血小板源生长因子B(PDGFB)是一种刺激结缔组织增生的肽类调节因子，其在DM并发症的发病机制中发挥重要作用而倍受关注。血管紧张素Ⅱ受体1(AT1受体)拮抗剂(ARB)可通过选择性地阻断血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)与AT1受体结合,延缓DM肾脏纤维化的进展，并能阻止或逆转高血压性心脏病及心肌梗死后的心肌重塑，其作用得益于ARB降压以外的保护作用。关于ARB在DM中的心脏保护作用及其机制的研究方兴未艾。本研究观察缬沙坦干预对DM大鼠心肌PDGFB表达以及细胞外基质(ECM)含量、心肌纤维化的影响，以期为防治DC提出新的思路。

　　1 材料与方法

　　1.1 DM大鼠模型的建立和分组

　　选择8周龄体重220～250 g雄性SD大鼠(上海斯莱克实验动物有限公司提供)32只，随机分成正常对照组(N)8只，DM组24只，采用一次性腹腔内注射1%链脲佐菌素(STZ,Sigma公司，55 mg/kg)，72 h后尾静脉采血用血糖仪(Roche公司)测定血糖，≥16.7 mmol/L者确定为DM模型，N组注射等量的枸橼酸缓冲液。DM组成模后，随机分为DM未治疗组(D)、缬沙坦小、大剂量(10、30 mg·kg-1·d-1)治疗组(Dval1、Dval2)各8只。缬沙坦由北京诺华制药有限公司提供。Dval1组、Dval2组每日灌胃给药1次，D组、N组予等量蒸馏水灌胃，共12 w。

　　1.2 观察指标和检测方法

　　1.2.1 血糖及体重(BW)

　　每2周测定空腹血糖(FBG)、称体重1次。

　　1.2.2 心体比(H/B)和左室重量指数(LVMI)

　　灌胃给药12 w处死各组大鼠，剪取、称量全心重(HW)、左心室重量，计算HW/BW(H/B)和LVMI〔左心室重(LVW)与BW比〕。

　　1.2.3 血浆和左心室心肌AngⅡ浓度测定

　　大鼠断头取血于预冷的酶抑制剂抗凝管中(含NaEDTA，8羟基喹啉，二巯基丙醇)离心分离血浆，-70℃保存。取左室心尖心肌于预冷的0.9% NaCl溶液中冰浴匀浆，加酶抑制剂，煮沸10 min，离心，分离上清-70℃保存。AngⅡ浓度测定采用125IAngⅡ标记的放射免疫分析，以SN682B3型放射免疫γ计数器记录结果。血浆、心肌AngⅡ浓度分别用pg/ml和pg/100 mg作单位。本试剂盒测定范围10～2 000 pg/ml,批内变异系数CVw<5%，批间变异系数CVb<10%。

　　1.2.4 心肌天狼星红染色及胶原容积分数(CVF)测定

　　在心肌冠状沟下约1 mm处，取左室心肌横切面。用10 %福尔马林固定，石蜡包埋，制片，切片厚约6 μm。饱和苦味酸天狼星红染色法使胶原特殊染色，心肌细胞呈黄色，胶原呈红色。光学显微镜下观察心肌切片胶原沉积的情况，并予拍照记录。于心肌(不包括小动脉)及心肌小动脉周围分别随机选取5个视野，Motic images advanced 3.0 图像分析系统(麦克奥迪公司)测量每个视野下心室胶原面积和统计场总面积，两者比值即为CVF。

　　1.2.5 RTPCR检测大鼠心肌PDGFB、纤维连接蛋白(FN)、Ⅲ型胶原(ColⅢ)mRNA的表达

　　以Vector NTI 5.5软件设计各基因PCR引物，由中科院开瑞公司合成。引物的核苷酸序列和扩增产物大小为：PDGFB,5′ACGCGTACAGAGGTGTTCCAG3′和5′GGGTCACTGTGGCCTTCTTG3′,219 bp;纤维连接蛋白(FN)，5′TGCTGGGACTTCCTACGTCG3′和5′CGTTTGAGTTGCCACCGTAAG3′,496 bp;ColⅢ,5′GGAGGAATGGGTGGCTATCC3′和5′TGTCCTGGAGAGCCATTTGAG3′,601 bp;βactin,5′CGGCATTGTAACCAACTGGG3′和5′CCTCTCAGCTGTGGTGGTGA3′,400 bp。RTPCR 条件均为:逆转录55℃ 30 min;预变性94℃ 3 min;扩增反应运行30个循环,94℃ 30 s，55℃ 1 min，72℃ 1 min;延伸72℃7 min。PCR产物在2%琼脂糖凝胶上进行电泳,利用凝胶成像系统(BIORAD公司)进行照相和吸光度扫描。目的基因表达水平以其吸光度与内参照βactin吸光度的比值表示。

　　1.3 统计学处理

　　计量资料以x±s表示，组间差异比较采用t检验或ANOVA检验，组间两两比较采用LSD法。应用SPSS13.0软件进行统计分析。

　　2 结果

　　2.1 缬沙坦治疗对DM大鼠血糖、H/B、LVMI的影响

　　不同剂量缬沙坦治疗均对DM大鼠血糖无影响(P>0.05);D组H/B、LVMI均较N组明显增高(P<0.01);Dval1组H/B及LVMI较D组降低(P<0.05)，Dval2组下降程度更明显(P<0.01)。见表1。表1 各组大鼠H/B、LVMI、FBG及AngⅡ的比较(略)

　　2.2 缬沙坦治疗对DM大鼠血浆及心肌AngⅡ水平的影响

　　D组血浆及心肌AngⅡ均较N组明显增高(P<0.01);缬沙坦治疗阻断AT1受体后血浆及心肌AngⅡ较D组及N组代偿性增高(P<0.01)，Dval2组较Dval1组增高更明显。见表1。表1 各组大鼠H/B、LVMI、FBG及AngⅡ的比较(略)

　　2.3 缬沙坦治疗对DM大鼠心肌CVF的影响

　　大鼠心肌切片用饱和苦味酸天狼星红染色法使胶原特殊染色后，在光学显微镜下观察，可见心肌细胞显黄色，在心肌细胞间和小动脉周围有红色的纤维状沉着，此即为胶原。与N组大鼠相比较，D组心肌切片中的胶原明显增多，Dval1、Dval2组心肌中的胶原有减少的趋势，其中以Dval2组的效果最为明显，已接近N组大鼠的水平，见图1。D组心肌组织CVF及心肌小动脉周围CVF均较N组明显增高(P<0.01)。Dval1组心肌CVF、小动脉周围CVF均较D组降低(P<0.01)，Dval2组较Dval1组下降程度更明显(P<0.01)。表明缬沙坦能剂量依赖性的减轻心脏胶原沉积，但仍未达到N组水平。见表2。表2 各组大鼠CVF比较(略)

　　2.4 缬沙坦治疗对DM大鼠心肌FN、ColⅢ及PDGFB mRNA表达的影响

　　D组FN、ColⅢ、PDGFB mRNA表达显著高于N组(P<0.01);Dval1、Dval2组FN、ColⅢ、PDGFB mRNA的表达均较D组降低(均P<0.01)，Dval2组较Dval1组下降程度更明显，差别有统计学意义(P<0.01)。见图2，表3。表明缬沙坦治疗能显著下调PDGFB在糖尿病大鼠心肌中的表达，并呈剂量依赖性。表3 各组大鼠心肌PDGFB、FN、ColⅢ mRNA表达的比较(略)

　　3 讨论

　　本研究以STZ腹腔注射SD大鼠，成功建立DM模型，在病程12 w出现心肌肥厚，FN、ColⅢ等心肌ECM表达增高，间质纤维化，呈现DC的病理特点。PDGF是一种细胞强有丝分裂原和化学驱动剂，其B链即PDGFB能促使细胞进入G1S细胞周期，具有诱导ECM产生积聚的特性〔2〕。本研究结果显示，DM大鼠心肌PDGFB表达显著上调，且与FN、ColⅢ表达水平升高相关。Wang等〔3〕研究证实重组PDGFBB(rhPDGFBB)可提高NRK49F肾间质成纤维细胞ColⅢ的表达。Kelly等〔4〕用高级糖基化终末产物(AGE)形成的抑制剂氨基胍治疗DM大鼠，明显减少了DM大鼠肾脏PDGFBB mRNA的高表达，降低了肾间质中的胶原沉积。由此可见，PDGFB参与DC的病理过程，是导致心肌纤维化的重要介质。已有研究表明，在大鼠和人类肾病中应用特异性PDGFB拮抗剂是安全和有效的〔5，6〕。因此PDGFB可能为DC的防治提供新的靶点。

　　本研究结果还显示，缬沙坦在有效抑制AT1受体的同时，可剂量依赖性地减轻DM大鼠心肌肥厚和间质纤维化，减少FN、ColⅢ等ECM成分，下调PDGFB的表达。在其他ARB干预DM的动物实验中发现相似的作用和益处，氯沙坦治疗可明显下调DM大鼠肾组织PDGFB蛋白表达，显著减少DM大鼠尿蛋白排泄及肾皮质Ⅳ型胶原mRNA的表达〔7〕。DM鼠动脉粥样斑块形成区域AT1受体表达明显增高，同时伴有PDGFB表达增高，厄贝沙坦治疗明显降低其动脉粥样硬化的发展，同时降低了AT1受体、PDGFB在动脉的过表达〔8〕。已有研究证实，心肌细胞内含有血管紧张素原mRNA，可合成和分泌心肌局部的AngⅡ，AngⅡ可促进DM大鼠心肌成纤维细胞的胶原合成，该作用可能主要通过AT1受体介导完成〔9〕。AngⅡ可以促进PDGFB的生成和分泌，AngⅡ与AT1受体结合后，导致G蛋白或酪氨酸蛋白激酶偶联的磷脂酶C(PLC)/PLD激活，使二酰甘油(DAG)生成增多，活化PKC系统。活化的PKC顺次激活磷酸化激酶raf1、有丝分裂原元件激酶MEK、有丝分裂原活化蛋白激酶MAPK，促使Cfos和Cjun表达增多，形成活化蛋白1(AP1)样转录因子促进PDGFB的转录〔10〕;活化的PKC系统还可通过磷酸化IKB，引起NFκB与胞浆结合蛋白IKB的解离，激活NFκB，促进PDGFB的表达〔11〕。鉴于PDGFB在DM的心肌ECM聚集和心脏结构重塑中发挥重要作用，PDGFB表达下调可能是缬沙坦抑制DM心肌纤维化的心脏保护作用机制之一。缬沙坦干预可能通过阻断AT1受体，下调PDGFB的表达，减轻心肌肥厚、ECM积聚和间质纤维化，达到改善心脏结构，阻止或延缓心衰的发生发展，在DM心肌病防治的临床应用中具有现实意义。

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