大肠癌转移淋巴结构建人源性抗大肠癌噬菌体Fab抗体库

　　作者：刘锐 孙立娟 何成彦 周劲松 作者单位：吉林大学中日联谊医院内分泌科，吉林 长春 130033

　　【摘要】 目的 构建人源性抗大肠癌噬菌体Fab抗体库。方法 术中剥取老年大肠癌患者系膜内转移淋巴结，提取细胞总RNA，逆转录合成cDNA，进行PCR，克隆于pComb3 载体,再经电转化大肠杆菌XLIBlue菌株,形成噬菌体抗体库，最后通过免疫印记法鉴定初级抗体库中噬菌体上有Fab段的表达。结果 从系膜内转移淋巴结中扩增出650 bp重链Fd和轻链基因产物，轻链基因产物插入测得转化菌数为4.7×106，鉴定插入率为70%;重链Fd基因产物测得转化菌数为3.5×106，插入率为60%;免疫印迹法鉴定成功建立噬菌体Fab抗体库，库容量达1.4×106。结论 筛选大肠癌特异性抗原和相应噬菌体抗体，对大肠癌发病机制的研究以及探讨早期诊断方法有重要意义。

　　【关键词】 大肠癌;噬菌体;抗体

　　目前所知的与大肠癌相关的抗体不仅有限，而且特异性不高，因此寻找大肠癌相关特异性抗原以及高特异性、高亲和性抗体一直备受学者关注。抗体技术已发展到基因工程阶段，人源性基因工程抗体异源性弱，利用抗体工程技术可提高其亲和力，延长半衰期。用PCR技术克隆抗体可变区基因和在大肠杆菌中表达有抗体活性的免疫球蛋白分子片段，是基因工程抗体技术的两个关键基础条件。噬菌体抗体库技术就是在此基础上发展起来并得到应用。目前国内外已有学者开展了大肠癌抗体库的研究，并建立了相应库容的大肠癌噬菌体抗体库〔1，2〕。本研究首先从大肠癌患者转移的淋巴结构建人源性抗大肠癌噬菌体Fab抗体库，并为进一步研究工作奠定基础。

　　1 资料与方法

　　1.1 病例选择

　　随机选取5例于我院行大肠腺癌(C期2例，D期3例)根治术的患者，年龄均>60岁,术中剥取系膜内转移淋巴结3～5枚，共18枚(直径均1 cm以上，将所取淋巴结剖为两半，一半留作建库用，一半送检病理)，切取大肠癌组织及正常大肠黏膜层组织各1 g左右。术后这5例患者的切除标本均经病理诊断证实为大肠腺癌，所取18枚淋巴结中，14枚病理诊断证实为转移淋巴结。切取大肠癌组织及正常大肠黏膜层组织各1 g左右。随即置液氮中保存备用。

　　1.2 载体、菌株和辅助噬菌体

　　采用噬菌体载体pComb3,由The Scripps Research Institute提供，含质粒CO1E1的起始位点、F1噬菌体的复制起始位点及氨苄青霉素(Amp)抗性基因;轻链及重链Fd的表达均受Lacz启动子控制。整个载体大小4 890 bp。宿主菌采用大肠杆菌XLIBlue,由The Scripps Research Institute提供,基因型Tn10上带有四环素(Tet)抗性基因。辅助噬菌体采用VCSM13，由The Scripps Research Institute提供，含卡那霉素(Kan)抗性基因，滴度1 012 pfu/ml。自行培养扩增后4℃保存。

　　1.3 主要试剂

　　RTPCR和PCR试剂盒购自Promega，限制性内切酶和连接酶购自 Promega。RTPCR和PCR引物参照The Scripps Research Institute提供的引物组设计,由上海基康生物技术公司合成。其他化学分析试剂、细菌培养平皿等为国产。

　　1.4 淋巴细胞的分离纯化、细胞总RNA的提取(Trizol法)、cDNA的合成(Gibco BRL法) 均按试剂盒说明进行。

　　1.5 PCR扩增Fab抗体基因

　　1.5.1 引物序列

　　见表1。表1 引物序列(略)

　　1.5.2 PCR扩增Fd及轻链基因

　　(1)在250 μl薄壁PCR反应Eppendorf管中加入：cDNA 2 μl;5′端引物(60 pmol/L)1 μl; 3′端引物(60 pmol/L)1 μl;去离子水71 μl 置94℃ 4～5 min后，立即置于冰上，瞬时离心，在管中加入：10×PCR缓冲液10 μl;25 mmol/L MgCl2 6 μl;10 mmol/L dNTPs 8 μl;Taq酶(5 U/μl)0.5～1 μl，瞬时离心后，加入1～2滴液体石蜡。(2)反应条件：94℃，1 min;52℃，1 min;72℃，2 min。35个循环，72℃延伸10 min，置于4℃。(3)每个反应管中各取5 μl PCR反应物，加入适量TAE缓冲液及DNA凝胶电泳加样缓冲液，在0.8%～1%琼脂糖凝胶中电泳。

　　1.6 PCR产物的纯化(spinX纯化方法)。

　　1.7 Fd和轻链基因的克隆及噬菌体抗体库的建立

　　1.7.1 噬菌体载体pComb3 DNA的制备

　　将pComb3载体DNA转化XLIBlu感受态菌，挑取单个菌落接种入30～40 ml SBA+培养液，次日转种500 ml SBA+培养过夜DNA提取试剂盒1提取质粒DNA，最后制成5 μg/μl浓度左右的质粒DNA。

　　1.7.2 载体DNA和纯化PCR产物的酶切

　　首先将所有不同的重链PCR产物，κ链PCR产物，以及 PCR产物分别按各自组群混合。在pComb3系统中，用于重链插入的酶切位点为SpeⅠ和 XhoⅠ;而用于轻链插入的酶切位点为XbaⅠ和 SacⅠ。酶缓冲液的使用：酶切反应按常规进行，反应后进行电泳以纯化所需的片段。

　　1.7.3 Fd和轻链基因的克隆

　　(1)轻链抗体基因的克隆;取上述经XbaⅠ和 SacⅠ酶切消化，并经电泳纯化后的pComb3载体DNA 1.5～2 μg，轻链混合物500～700 ng，加2 μl高浓度连接酶进行连接。取事先制备好的电转感受态菌XLIBlue 400 μl加入上述连接产物，置冰浴中进行电转化。电转后立即转入细菌培养箱中。取30 μl培养液分别涂于含有氨苄青霉素的LB平皿，检测转化效率。用DNA纯化试剂盒制备上述含有轻链基因插入的pComb3质粒DNA，并测定DNA含量。鉴定插入效率，随即挑取20个克隆，提取质粒DNA后，用XbaⅠ和 XacⅠ酶切。(2)重链基因的克隆及噬菌体抗体库的建立:取上述的纯化pComb3LDNA质粒10 μg，混合的纯化重链PCR产物500 ng，用XhoⅠ和 SpeⅠ分别进行酶切反应。电泳回收相应的条带，纯化后测定DNA含量。取酶切消化后回收纯化的载体DNA及重链PCR产物进行连接。重复轻链克隆步骤。加入100 ml SBA+T+;37℃震荡培养1 h。加入1 012 pfu/ml的辅助噬菌体VSCM13，37℃震荡培养2 h。加入70 μg/ml卡那霉素，37℃震荡培养过夜。将上述细菌培养液于4℃以4 000 r/min离心15 min。取上清加入4%PEG8000和3%NaCl，待PEG和NaCl溶化后，置三角瓶于冰浴中沉淀30 min。于4℃以9 000 r/min离心20 min。用2 ml PBS(pH7.2)重悬噬菌体沉淀，瞬时离心，上清即为噬菌体抗体库，待用或存放于-20℃。

　　1.8 免疫印迹法鉴定初级抗体库中噬菌体上有Fab段的表达

　　将建成的噬菌体Fab初级抗体库悬液直接点于硝酸纤维膜(NC)片上，以pComb3噬菌体空载体悬液作阴性对照,进行免疫印迹分析，显色后对两组NC膜进行比较，鉴定初级抗体库中噬菌体上有Fab段的表达。

　　2 结果

　　2.1 大肠癌淋巴结抗体重链Fd基因和轻链基因的扩增及鉴定

　　采用Trizol一步法自大肠癌患者转移淋巴结中提取总RNA后，以其为模板RTPCR合成抗体重链Fd和轻链基因cDNA，再以该cDNA为模板，PCR扩增抗体重链Fd和轻链基因，在1%琼脂糖凝胶DNA电泳中，可获得650 bp产物条带，即为重链Fd和轻链基因产物，见图1。

　　2.2 轻链和重链Fd基因的克隆及噬菌体Fab抗体库的建立

　　将PCR扩增的轻链基因产物插入载体pComb3后，电转感受态XLIBlu菌，扩增培养后，测得转化菌数为4.7×106，随机挑取20个单菌落，提取质粒DNA，鉴定插入率为70%，见图2。将PCR扩增的重链Fd基因产物插入有轻链基因插入的pComb3载体DNA pComb3L，电转感受态XLIBlu菌，扩增培养后，测得转化菌数为3.5×106，随机挑取20个单菌落，提取质粒DNA，鉴定轻链基因的插入率为60%，见图3。

　　2.3 鉴定初级抗体库中噬菌体上有Fab段的表达

　　以辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗人IgG行免疫印迹检测醋酸纤维膜上Fab初级抗体库，结果均显色。而作为阴性对照的pComb3噬菌体空载体悬液则未显色。表明初级抗体库中噬菌体上有Fab段的表达，见图4。

　　3 讨论

　　在构建噬菌体抗体库时，首先必须克隆出B细胞的全套可变区基因。实验表明，杂交瘤细胞、脾细胞、淋巴结细胞、外周血淋巴细胞、甚至体外免疫的细胞都可以作为建库的来源。根据有些学者研究提示，在这些细胞中，以选用淋巴结细胞建库为更好〔3〕，因为这种细胞有利于筛选到亲和力高和特异性的抗体。本研究所建的抗体库是从经病理证实的大肠癌患者转移淋巴结构建的，因未经人工免疫，所以属于天然抗体库。尽管如此，但人具有的巨大的V基因库仍然是经过繁殖剔除的，这些B细胞一直接触许多不同种类的抗原，尤其是接触肿瘤抗原，在肿瘤抗原的压力选择下已发生基因重排，因此，此类抗体库的库容会小于天然抗体库，但从此类抗体库中却容易筛选到高亲和力的特异性肿瘤抗体。在丧失了一定的多样性的同时，获得了较高的特异性和亲和性。

　　噬菌体抗体库技术使用的载体都是在已有的噬菌粒基础上进行改建的,噬菌粒作为载体的优点是转化率高。但是,此类载体需要有辅助噬菌体来产生单链基因并组装成有感染力的噬菌粒。为了更有效地合成表达抗体库,各国学者在载体构建方面作了一些探索〔4，5〕。本研究中所采用的pComb3是一个建库所需的常用载体，使用这些载体构建抗体基因库时,获得的全套重链抗体基因与轻链基因以适当的内切酶消化后,克隆进载体相应酶切位点。目前国内外学者在建库时通常使用该噬菌体载体，因为本实验策略是建立和验证设计的双盲法筛选大肠癌特异性抗原和抗体的方法，建库的目的是为了获得用于进一步筛选的噬菌体试剂，筛选和鉴定有价值的大肠癌抗原和抗体将是以后进一步深入的工作，因此未选用特殊改良的方法、复杂且经费较高的载体。

　　如前所述，本研究建立的抗体库已在体内被肿瘤细胞抗原免疫过，所以近似免疫抗体库，虽然此库容量不算太大，库容量为1.4×106，但许多实验室已从此种抗体库中比较容易的筛选出高亲和力的抗体。而该抗体库用没有免疫机体的其他抗原筛选时，其抗体的亲和力降低十倍。用HIV阳性病人淋巴细胞构建的一个抗体库，当用于筛选抗MHCⅡ、抗dsDNA、CD14、EGF受体和抗GD2的抗体时，其亲和力只有10-3 mol/L，而用同一个库筛选抗gp120的抗体时的亲和力达10-8 mol/L〔6〕。这些结果表明，经免疫过的淋巴细胞所构建的抗体库对于筛选特定抗原的片段抗体是非常合适的。

　　【参考文献】

　　1 吴保平，肖 冰，万田谟，等.结肠癌患者淋巴结构建抗结肠癌噬菌体Fab抗体库〔J〕.中华消化杂志，2002;1(22)：158.

　　2 Pimenidou A, Madden LA, Topping KP, et al.Novel CD43 specific phage antibodies react with early stage colorectal tumours〔J〕.Oncol Rep,2004;11(2):32731.

　　3 Grabert RC, Cousens LP, Smith JA, et al. Human T cells armed with Her2/neu bispecific antibodies divide, are cytotoxic, and secrete cytokines with repeated stimulation〔J〕. Clin Cancer Res, 2006;12(2):56976.

　　4 Den W, Sompuram SR, Sarantopoulos S, et al. A bidirectional phage display vector for the selection and mass transfer of polyclonal antibody libraries〔J〕. J Immunol Methods, 1999;22(2):4557.

　　5 Son JH, Lee UH, Lee JJ, et al. Humanization of agonistic antihuman 41BB monoclonal antibody using a phagedisplayed combinatorial library〔J〕. J Immunol Methods, 2004;28(6):187201.

　　6 Akhilesh P, Matthias M. Proteomics to study genes and genomes〔J〕. Nature, 2000;405(15):8378.