血管网状细胞瘤 Von Hippel-Lindau病 遗传性疾病

　　作者：罗冬冬 作者单位：温州医学院第一附属医院，浙江 温州 325027，1.内分泌科;2.医科所

　　【摘要】 目的:探讨川芎嗪对高糖环境下大鼠肾小球系膜细胞(MCs)增殖及其细胞外基质含量的影响。方法:体外培养大鼠肾小球系膜细胞株，分对照组、高糖组、TMP组，分别培养12 h、24 h、48 h，CASY细胞计数仪计数细胞存活率;以CCK-8法检测细胞增殖;以ELISA法检测细胞上清液细胞外基质Col IV及FN的含量。结果:各TMP浓度组之间存活率无统计学差异(P>0.05);与对照组比较，高糖下培养24 h、48 h MCs增殖显著增快(P<0.01)，分泌的Col IV及FN含量增多(P<0.05);与高糖组比较，TMP各组MCs增殖显著减慢(P<0.01)，分泌Col IV及FN减少(P<0.01或P<0.05)。结论:川芎嗪可以有效抑制高糖的促增殖作用并能减少系膜细胞外基质的增加。

　　【关键词】 糖尿病肾病 川芎嗪 细胞增殖 细胞外基质 大鼠

　　Effects of tetramethylpyrazine on proliferation of mesangial cells and the concentration of extracellular matrix in high glucose cultured rat mesangial cells LUO Dong-dong*,WANG Da-wang,NI Lian-song，SHEN Fei-xia, XIONG Shu-dao.*Department of Endocrinology, the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College, Wenzhou, 325027

　　Abstract: Objective: To explore the effects of tetramethylpyrazine on proliferation of mesangial cells and the concentration of extracellular matrix in high glucose cultured rat mesangial cells. Methods: Rat mesangial cells were divided into control group， high glucose group and TMP group, and were cultured for 12 h, 24 h and 48 h. At indicated time points, cellular survival rate and proliferation were identified with cell counting instrument and CCK-8, The supernatants were collected and the Collagen type IV and Fibronectin were detected with enzyme-linked immunosorbent assay. Results: The survival rates of different groups were not involved (P>0.05). Compared with control group, the cellular proliferation and the concentration of Collagen type IV and Fibronectin increased in high glucose group at 24 h and 48 h (P<0.05). Compared with that in high glucose group, the cellular proliferation and the concentration of Collagen type IV and Fibronectin declined in different concentration TMP groups (P<0.01,P<0.05). Conclusion: Tetramethylpyrazine can significantly inhibit proliferation and secretion of Collagen type IV and Fibronectin in high glucose induced rat mesangial cells.

　　Key words: diabetic nephropathy; tetramethylpyrazine; cellular proliferation; extracellular matrix; rat extracellular matrix

　　糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)的主要病理改变是系膜细胞增殖及纤维连接蛋白(Fibronectin，FN)、Ⅳ型胶原(Collagen type IV，Col IV)等细胞外基质(extracellular matrix，ECM)成分增多。川芎嗪又名四甲基吡嗪(tetramethylpyrazine，TMP)，是从伞形科藁本属植物川芎根茎中提取分离的生物碱单体，具有改善微循环、血液流变学，降血糖、抗氧化、抗纤维化和拮抗钙离子等药理作用，已广泛应用于心、脑、肺、肾及血管疾病的治疗，大量临床及动物实验证明TMP对DN有很好的疗效。本研究观察了TMP对高糖环境下大鼠肾小球系膜细胞(rat mesangial cells，MCs)增殖及FN、Col IV含量的影响，进一步探讨TMP对糖尿病肾病的保护作用及其可能机制。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 大鼠肾小球系膜细胞株购自上海长征医院;盐酸川芎嗪粉剂购自山东长富洁晶药业有限公司;正常葡萄糖(含5.5 mmol/L D-葡萄糖)及高糖(含25 mmol/L D-葡萄糖)DMEM培养液购自美国Gibco公司;胎牛血清(FCS)购自天津正江高科技有限公司;CCK-8试剂购自上海同仁化学研究所;FN及IV型胶原ELISA试剂盒购自美国ADL公司;酶标仪(BIO-TEK FL-800美国产品);细胞分析仪/CASY细胞计数仪(德国CASY公司产品)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 以CCK-8法检测细胞增殖活力：取对数生长期MCs细胞，以2000个/孔铺于96孔板，待MCs细胞贴壁后，吸去原有DMEM培养液，换为1% FCS培养液,培养24 h使所有细胞的生长同步化。随机分5组:①对照组(5.5 mmol/L D-Glu DMEM培养液)。②高糖组(25 mmol/L D-Glu DMEM培养液)。③TMP低剂量组(高糖培养液+200μg/ml TMP)。④TMP中剂量组(高糖培养液+500μg/ml TMP)。⑤TMP高剂量组(高糖培养液+1000μg/ml TMP)。每组设6个复孔，分别作用12 h、24 h、48 h，于每个时间点结束前1 h加入10μl/孔CCK-8，37 ℃、5% CO2条件下继续培养1 h后检测OD450。

　　1.2.2 检测细胞存活率：按上述培养、分组和作用方法，用9.9 ml缓冲液，0.1 ml细胞悬液于CASY细胞计数/分析仪器上直接检测细胞存活率。

　　1.2.3 检测细胞上清中Col Ⅳ和FN含量：双抗体夹心酶联免疫吸附(ELISA)法检测细胞上清中Col Ⅳ和FN含量,按试剂盒说明书操作。每项指标每组设6孔，根据标准品的标准曲线求出相应的含量，为排除细胞数目对上清中Col Ⅳ和FN含量的影响，对每孔细胞数目进行校正，按每孔细胞数为1×106个来校正所得数据。

　　1.3 统计学处理方法 采用SPSS12.0统计软件，采用单因素方差分析，方差齐者组间比较用LSD-t检验，方差不齐者用Tamhane's T2检验。

　　2 结果

　　2.1 TMP对MC存活率的影响 各组存活率均大于90%，差异无统计学意义(均P>0.05)，见表1。

　　2.2 TMP对MC增殖活力的影响 与对照组比较，高糖可以促进MCs增殖，24 h、48 h高糖组OD值明显升高(P<0.01)，且随着时间的延长高糖促增殖作用更加明显。TMP干预组明显抑制系膜细胞增殖，与高糖组比较OD值差异具有显著性(P<0.01)，并且恢复至接近于甚至低于对照组水平(24 h TMP各剂量组及48 h TMP高剂量组P<0.01)，见表2。

　　2.3 TMP对MCs分泌的FN及Col Ⅳ的影响 与对照组比较，高糖组的12 h、24 h、48 h FN及Col Ⅳ含量明显增加(P<0.05);与高糖组相比，12 h、24 h TMP的高剂量组与中剂量组及48 h TMP各剂量组FN及Col Ⅳ含量均有降低(P<0.01或P<0.05)，但不能恢复至低糖对照组水平;与对照组相比，TMP不同剂量组FN及Col Ⅳ含量差异无显著性(P>0.05)，见表3、表4。

　　3 讨论

　　以往的研究认为,高糖环境对MCs的生长具有双向调节作用，在培养早期(24～48 h)高糖能促进MCs增殖，此后高糖对MCs增殖起抑制作用[1]。在本实验中，用高糖刺激24 h、48 h后MCs增殖活性明显增强,与文献报道一致。有研究发现TMP对体外培养的正常葡萄糖浓度的人胎肾小球系膜细胞增殖有抑制作用，并认为其抑制增殖的机制与其干扰IL-6的产生有关[4];TMP对脂多糖(LPS)诱导的MCs增殖亦有抑制作用[5]。本实验中，TMP和高糖共同培养MCs 12 h、24 h、48 h后，发现TMP对高糖诱导的MCs增殖具有明显的抑制作用，在一定的范围内浓度越高，抑制作用越强;而且TMP不同剂量组与对照组及高糖组之间细胞存活率无明显差异，提示应用TMP干预治疗DN时不会对肾脏系膜细胞产生毒性作用，对其临床应用的安全性提供了理论依据。

　　DN的基本病理改变包括肾小球肥大、ECM增多和肾小球硬化。异常的ECM积聚主要表现为FN、Ⅳ型胶原以及层黏蛋白等过度增生。实验证明，无论是糖尿病动物模型还是体外高糖环境培养的肾小球系膜细胞，高糖时ECM的合成是增加的，包括Ⅰ型、Ⅲ型、Ⅳ型胶原以及层黏蛋白、FN 等，被认为与PKC系统和(或)TGF-β1激活有关[2]。本实验发现，在高糖环境下的各组MCs上清液中分泌的FN、Col Ⅳ含量均明显高于对照组，与van Det等[3]的报道一致。有实验证明，TMP具有拮抗钙和抗纤维化的作用,在延缓肾小球硬化的进程中起着重要的作用，并初步表明TMP能在体外有效发挥抗肾间质纤维化的作用[6，7]。本实验结果亦表明，川芎嗪能明显减少高糖刺激下的肾小球MCs外Col IV及FN的含量，但具体机制还有待进一步研究证实。

　　【参考文献】

　　[1] Wolf G. Molecular mechanisms of diabetic mesangial cell hypertrophy: a proliferation of novel factors[J]. J Am Soc Nephrol,2002,13(10):2611-2613.

　　[2] Caenazzo C,Garbisa S , Onisto M ,et al. Effect of glucose and heparin on mesangial alpha 1(IV)COLL and MMP-2/TIMP-2 mRNA expression[J]. Nephrol Dial Transplant, 1997,12 (3):443-448.

　　[3] Van Det N, Verhagen NA, Tamsma JT, et al. Regulation of glomerular epithelial cell production of fibronectin and trans-forming growth factor-beta by high glucose, not by angio-tensin II[J]. Diabetes,1997,46(5):834-840.

　　[4] 孙林,易著文,虞佩兰.川芎嗪对人胚肾小球系膜细胞增殖的影响及其机理探讨[J].中国中西医结合杂志,1995,15(3):134-136.

　　[5] 汪霞,倪七雄.川芎嗪对脂多糖诱导大鼠肾小球系膜细胞增殖及细胞间粘附因子-1表达的影响[J].中国临床药理学与治疗学,2004,9(4):420-422.

　　[6] 曹文富,李荣亨,陈伯煊,等.川芎嗪延缓慢性肾损害的实验及临床现状[J].中国中西医结合杂志,1997,17(5):314.

　　[7] 屈燧林,方勤,陈高翔,等.汉防己甲素、川芎嗪和苦杏仁甙对人肾成纤维细胞的影响[J].中华肾脏病杂志,2000,16(3):186-189.