波动性高糖对大鼠肾小球系膜细胞氧化应激的影响

　　作者：田晓玲，郑景晨，章海凌，沈飞霞，刘芳 作者单位：温州医学院第一附属医院 内分泌科，浙江 温州 325027

　　【摘要】 目的:对比研究波动性与稳定性高糖对肾小球系膜细胞(GMC)氧化应激的影响。方法:体外培养大鼠肾小球系膜细胞株，分正常糖对照组(5.5 mmol/L，NG)、稳定高糖组(25 mmol/L,HG)、波动性高糖组(5.5 mmol/L或25 mmol/L，每24 h交替，IHG)，培养GMC 6 d，分别以二氢二氯荧光素(DCFH-DA)标记细胞，通过流式细胞仪检测细胞内二氯荧光黄(DCF)的荧光强度而测得细胞内ROS水平，比色法检测细胞上清液中的总超氧化物歧化酶(T-SOD)活性和谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)含量的变化。结果:与NG组相比，HG组与IHG组细胞内DCF平均荧光强度均显著升高(均P<0.01)，总SOD活力均下降(均P<0.01)，GSH含量均下降(P<0.05，P<0.01)，MDA均升高(P<0.05，P<0.01)。与HG组相比，IHG组细胞内DCF平均荧光强度显著升高(P<0.01)，总SOD活力下降(P<0.01)，GSH含量下降(P<0.01)，MDA升高(P<0.05)。结论:波动性高糖较稳定性高糖可能对GMC有更强的氧化损伤效应。

　　【关键词】 波动性高糖;肾小球系膜细胞;氧化应激

　　Effects of intermittent high glucose on oxidative stress in rat glomerular mesangial cells in vitro TIAN Xiao-ling，ZHENG Jing-cheng，ZHANG Hai-ling，SHEN Fei-xia，LIU Fang. Department of Endocrinology，the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College，Wenzhou，325027

　　Abstract: Objective: To compare the effects of intermittent and constant high glucose on oxidative stress in cultured Rat Glomerular Mesangial Cells(GMC). Methods: GMC were cultured in normal glucose control group(5.5 mmol/l glucose，NG)，high glucose group(25 mmol/l glucose，HG)and intermittent high glucose group(5.5 mmol/l alternating with 25 mmol/l glucose on a daily basis，IHG)in vitro for 6 days. 2’，7’-dichlorofluorescein diacetate(DCFH-DA)was used as a reactive oxygen species(ROS)capture agent.The fluorescent intensity of 2’，7’-dichlorofluorescein(DCF)， which was the product of cellular oxidation of DCFH-DA，was detected by flow cytometry，and the level of ROS was thus measured.The activity of total superoxide dismutase(T-SOD)and the levels of ma1ondialdehyde(MDA)， glutathione(GSH)in supernatant were assayed using chromatometry. Results: Compared with NG group， the intracellular fluorescent intensity of DCF increased in HG group and IHG group (P<0.01，respectively)，and the activity of T-SOD decreased (P<0.01，respectively)，the level of GSH decreased(P<0.05，P<0.01)，the level of GSH increased (P<0.05，P<0.01). Compared with HG group，the intracellular fluorescent intensity of DCF increased in IHG group (P<0.01)，and the activity of T-SOD decreased (P<0.01)，the level of GSH decreased(P<0.01)，the level of GSH increased(P<0.05).Conclusion：Intermittent high glucose causes a more significant damage for oxidative stress to GMC.

　　Key words: intermittent high glucose;glomerular mesangial cell;oxidative stress

　　高血糖在包括糖尿病肾病在内的多种并发症的发生、发展过程中起重要作用。高血糖引起的体内活性氧簇(ROS)的改变可能是引起糖尿病肾病的重要原因之一。糖尿病患者高血糖有两种表现：慢性稳定性高血糖与慢性波动性高血糖[1]。高血糖及血糖波动幅度增大均是糖代谢紊乱加重的征象[2，3]。临床研究发现，旨在控制波动性高血糖的胰岛素强化治疗可明显降低糖尿病患者慢性并发症的发生[4]，提示波动性高血糖可能在糖尿病慢性并发症的发生中有着极其重要的病理学意义。本研究旨在观察波动性与稳定性高糖环境对肾小球系膜细胞内ROS的产生是否有不同影响，以揭示糖尿病肾病发生的可能机制。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 细胞株和试剂：大鼠肾小球系膜细胞株购自上海长征医院;正常葡萄糖(含5.5 mmol/L D-葡萄糖)及高糖(含25 mmol/L D-葡萄糖)DMEM培养液购自美国Gibco公司;胎牛血清(FCS)购自天津正江高科技有限公司;二氢二氯荧光素(DCFH-DA)购自Sigma公司。超氧化物歧化酶(SOD)、还氧型谷胱甘肽(GSH)、脂质过氧化物(MDA)测定试剂盒购自南京建成生物工程公司。

　　1.1.2 主要仪器：二氧化碳培养箱(Cellstar，美国)，FACS calibur流式细胞仪(Becton Dickison，美国)，紫外分光光度仪(BackmanDU460，美国)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 细胞培养：大鼠肾小球系膜细胞株购自上海长征医院肾内科，常规培养于含10% FCS的DMEM培养液中，每周传代2～3次。

　　1.2.2 实验分组与处理：取对数生长期GMC，按每孔约3×104个接种于6孔培养板中，待细胞贴壁后，吸去原有DMEM培养液，换为1% FCS培养液，培养24 h使所有细胞的生长同步化。按下列分组进行处理：①对照组(NG)：稳定正常糖浓度(5.5 mmol/L)DMEM培养液;②稳定高糖组(HG)：稳定高糖浓度(25 mmol/L)DMEM培养液;③波动高糖组(IHG)：5.5 mmol/L与25 mmol/L培养液24 h轮替。在37 ℃，5% CO2条件下培养6 d，每孔细胞均为每24 h换液一次，然后收集全部条件培养液，离心，取上清液于 -70 ℃保存备检测。

　　1.3 ROS捕获及流式细胞仪检测 用0.25%胰蛋白酶消化并离心收集上述贴壁细胞，细胞收集好后悬浮于无血清培养液稀释好的10μmol/L DCFH-DA中，使细胞浓度为(1×106～2×107)/ml，37 ℃细胞培养箱内孵育20 min。每隔3～5 min颠倒混匀一下，使探针和细胞充分接触，用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，立即在流式细胞仪上检测ROS水平，激发光为氩离子激光488 nm谱线，每个样品测定10 000个活细胞，检测各组细胞内二氯荧光黄(dichlorofluorescin，DCF)的荧光强度。

　　1.4 上清液总SOD活力、GSH及MDA含量的测定 将上述收集的细胞上清液，按试剂盒说明书进行检测。

　　1.5 统计学处理方法 所有试验均重复3次以上，统计学处理采用SPSS11.5统计软件，采用One-Way ANOVA-SNK法比较总体和组间差异。

　　2 结果

　　2.1 各组ROS水平的比较 NG、HG、IHG组GMC内DCF的平均荧光强度分别为(21.56±2.25)、(38.55±3.19)、(49.14±3.09)，与NG相比，HG和IHG组GMC内DCF的平均荧光强度均明显升高(均P <0.01)，且IHG组升高更为明显(P <0.01)。数据反映稳定高糖组及波动高糖组细胞内ROS生成均增加，波动高糖组更明显(见图1)。

　　2.2 各组总SOD活力、GSH及MDA含量的比较 波动高糖组与稳定高糖组的总SOD活力、GSH含量均下降，但前者下降幅度均高于后者(P <0.01)。波动高糖组与稳定高糖组的MDA均升高,但以波动高糖组明显(P <0.05)见表1。

　　3 讨论

　　高血糖是糖尿病的标志，也是导致糖尿病并发症的主要因素。早期的研究多关注于长期慢性(持续)高血糖与并发症的关系，近年来的研究表明，糖尿病慢性并发症的发生、发展不仅与整体(持续)血糖水平相关，而且与血糖的波动性(稳定性)密切相关[1，5]，其对靶器官的损伤主要通过慢性持续高血糖和血糖水平波动两种方式体现。因此，血糖的过度波动对靶器官的损伤和并发症的危险性，近年来倍受关注，成为糖尿病防治研究的新热点。

　　本实验以DCFH-DA作为ROS捕获剂，用流式细胞仪对细胞ROS的变化进行检测，进而比较不同高糖环境对氧化应激的影响。用流式细胞仪测定细胞内ROS水平是近年新发展起来的方法，其特点是快速、方便且重复性好。DCFH-DA是常用的检测试剂，主要检测H2O2和OH·，它可以自由进出细胞膜，进入细胞后可被ROS氧化为荧光物质DCF，后者被泵入线粒体内，从而维系在细胞内，经过一定时间的累积，即可通过流式细胞仪检出相应的荧光，并以此反映细胞内ROS的相对水平[6]。SOD、GSH为体内主要的抗氧化防御系统，它们的变化可以反映抗氧化系统的功能状态。MDA是细胞膜脂质过氧化作用的产物之一，它的产生还能加剧膜的损伤。因此，MDA产生数量的多少能够代表膜脂过氧化的程度，也可间接反映组织的抗氧化能力的强弱。

　　本实验发现，无论是稳定高糖还是波动性高糖，均可导致GMC细胞上清液总SOD活力、GSH含量降低，MDA含量增加，细胞内DCF的平均荧光强度增加。相对于稳定性高糖，波动性高糖使上述变化更为显著，说明波动性高糖可使氧化-抗氧化失衡进一步加剧，ROS产生增多，氧化应激损伤加重。以往的研究认为，高糖可以诱导GMC氧化应激[7]，氧化应激损伤在糖尿病肾病的发生与发展的过程中扮演重要角色[8]。本研究提示，血糖的不稳定性，可能为包括糖尿病肾病在内的多种糖尿病慢性并发症的独立危险因素，氧化应激损伤可能为其危险原因之一。

　　综上所述，波动性高血糖相对于稳定性高血糖，更能促进糖尿病肾病的发生与发展，其原因之一可能为氧化应激损伤的加重。在临床治疗上，良好的血糖控制要考虑量(空腹、餐后高血糖和HbA1c)和质(血糖稳定性)两方面因素[1]，抗氧化治疗有望成为糖尿病及其并发症治疗中一项新的策略。

　　【参考文献】

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