肾上腺切除后大鼠下丘脑室旁核MR、GR表达变化的研究

作者：张彦慧    作者单位：海南医学院组织学与胚胎学教研室，海南 海口 571101 【摘要】  目的：实施大鼠双侧肾上腺切除术，研究下丘脑室旁核盐皮质激素受体（MR）、糖皮质激素受体（GR）表达的变化。方法: 建立大鼠双侧肾上腺切除模型，于肾上腺切除后0，4，7 d取材；同时取材假手术组（未切除肾上腺）作为对照，应用免疫组织化学方法检测各组下丘脑室旁核神经元MR、GR的表达变化。结果: 肾上腺切除后，免疫组化结果显示，下丘脑室旁核的MR表达没有显著性变化，GR表达上调。结论:肾上腺切除后，下丘脑室旁核MR表达不变，GR表达上调。提示下丘脑室旁核的MR可能不直接参与HPA轴的调节，GR参与HPA轴的调节。

【关键词】  肾上腺 受体 盐皮质激素 受体 糖皮质激 丘脑 大鼠

    Expression of mineralocorticoid receptors and glucocorticoid receptors in the paraventricular nuclus of the hypothalamus after adrenalectomy

    ZHANG  Yanhui1, FU  Jiaorong1,  LU  Ping2

    (1.Department of Histology and Embryology，Hainan Medical College, Haikou 571101, China; 2.Department of pathology, Longnan Hospital of Daqing City, Heilongjiang Province, Daqing 163453, China )

    ［ABSTRACT］ Objective: To study the changes of expression of glucocorticoid receptor（MR）and mineralocorticoid receptor（GR）in the paraventricular nucleus of the hypothalamus after adrenalectomy. Methods： Models were made by removing bilateral adrenal glands of rats. Samples were taken from rats of adrenalectomy and intact rats for study and control respectively on the day 0,4,7. Immunohistochemical method was used to detect the changes of expressions of MR and GR in the paraventricular nucleus of the hypothalamus. Results： There was no significant change in the expression of MR after adrenalectomy; there was up regulation of the expression of GR after adrenalectomy. Conclusion： The results that expression of MR has no change and the expression of GR up regulates after adrenalectomy suggests that MR of the paraventricular nucleus of the hypothalamus may not participate the regulation of HPA axis directly and the GR of the paraventricular nucleus of the hypothalamus may participate the regulation of HPA axis.

    ［KEY WORDS］ Adrenal gland; Receptor, mineralocorticoid; Receptor, glucocorticoid; Thalamus; Rat

    下丘脑—垂体—肾上腺 (hypothalamicpituitaryadrenal， HPA) 轴作为神经内分泌免疫网络的枢纽，在机体内环境平衡维持及机体衰老过程的调节中起着十分重要的作用。糖皮质激素与皮质类固醇激素受体——盐皮质激素受体（mineralocorticoid receptor,  MR）和糖皮质激素受体（glucocorticoid receptor,  GR）结合，反馈作用于垂体和下丘脑构成HPA轴负反馈调节的主要通路［1］。其中下丘脑室旁核（periventricular nucleus,  PVN）有直接激活HPA轴的作用，是HPA轴的调节中心。本实验建立大鼠肾上腺切除模型，应用免疫组织化学方法观察了肾上腺切除后大鼠下丘脑室旁核MR、GR的表达变化，为进一步研究MR、GR在调节HPA轴中发挥的作用提供实验依据。

    1  材料和方法

    1.1  实验动物及分组

    成年健康雄性Wistar大鼠70只，体重200～220 g，中国医科大学实验动物中心提供，实验室条件饲养，随机分正常组、肾上腺切除0，4，7 d组及假手术组。每组10只。

    1.2  动物模型的建立

    将大鼠用戊巴比妥麻醉后，取俯卧位固定于蛙板上。从最后胸椎处向后沿背部正中线做约2 cm长的皮肤切口。在肾脏前内侧脊柱下方找到淡黄色的肾上腺并摘除，同法摘除右侧肾上腺(位置稍靠前)，缝合肌肉和皮肤，并涂以碘酊。对照组进行与实验组相似的手术，但不摘除肾上腺。术后保持室温为21～25 ℃，以葡萄糖液、生理盐水代替饮水。

    1.3  取材

    各组大鼠称体重后，腹腔内注射戊巴比妥麻醉，打开胸腔，从左心室插管至升主动脉，剪开右心耳，生理盐水快速冲洗后，4％的多聚甲醛灌流固定，取脑组织在同种固定液中续固定3 h，40％的蔗糖沉糖，制作冰冻切片，进行免疫组织化学染色。

    1.4  免疫组织化学SABC方法

    恒冷箱切片机（型号Leica）制作冰冻切片，厚14 μm，0.01 M PBS漂洗后切片依次经0.03% Triton x-100浸泡10 min、3%H2O2甲醇20 min以阻断内源性过氧化物酶、5％BSA 封闭20 min后滴加兔抗MR、GR抗体（MR工作浓度为1∶200、GR工作浓度为1∶500 MR、GR均购于Santa Cruz Biotechnology公司），4 ℃冰箱孵育过夜,（对照组加0.01 M PBS代替一抗）再滴加生物素化羊抗兔IgG和即用型SABC（免疫组化试剂盒购自武汉博士德公司）,以上各步间用0.01 M PBS漂洗, DAB显色,脱水,透明,封片,光学显微镜(OLYMPUS, BX60,Japan)下观察并摄片。

    1.5  图像及统计学分析

    采用Motic Images Advanced 3.2图像分析系统，在下丘脑室旁核区测每高倍（10×40倍）视野内MR、GR 的光密度值，每张切片选2～3个视野，计算各组平均光密度（IOD）。所得数据用SPSS13.0软件处理，采用方差分析进行两两比较，以 P<0.05为有统计学意义。

    2  结果

    2.1  MR免疫组织化学染色结果

    正常组、假手术组及肾上腺切除组MR免疫反应阳性产物呈棕黄色表达,位于室旁核神经元的细胞质和细胞核内。各组免疫反应阳性神经元的数目及染色强度无明显变化（P＞0.05）（表1、图1）。表1  下丘脑室旁核MR免疫反应平均 光密度值（OD）注：与正常组、假手术组比较 *P＞0.05，**P＞0.05，***P＞0.05；与肾上腺切除4 d组比较***P＞0.05。注：①正常组下丘脑室旁核MR免疫反应阳性细胞(×400);②肾上腺切除组（0 d）下丘脑室旁核MR免疫反应阳性细胞(×400);③肾上腺切除组（4 d）下丘脑室旁核MR免疫反应阳性细胞 (×400);④肾上腺切除组（7 d）下丘脑室旁核MR免疫反应阳性细胞 (×400)。

    2.2  GR免疫组织化学染色结果

    GR免疫反应阳性产物呈棕黄色表达，正常组、假手术组的GR主要分布在室旁核神经元的细胞质与细胞核中。肾上腺切除组：0 d组GR免疫反应阳性细胞数目、染色强度与正常组、假手术组相比，无显著性差异（P＞0.05）。4,7 d组GR免疫反应阳性细胞数较正常组、假手术组明显增多，染色深（P＜0.05），免疫反应阳性产物主要分布在细胞质中， 7 d组较4 d组免疫反应阳性细胞多，染色更深，表达增强（P＜0.05）(表2、图2)。  表2  下丘脑室旁核GR免疫反应平均光密度值（OD）（注：与正常组、假手术组比较*P＜0.05，**P＜0.05；与肾上腺切除4 d组比较**P＜0.05。。

    注：①正常组下丘脑室旁核GR免疫反应阳性细胞(×400);②肾上腺切除组（0 d）下丘脑室旁核GR免疫反应阳性细胞(×400);③肾上腺切除组（4 d）下丘脑室旁核GR免疫反应阳性细胞(×400);④肾上腺切除组（7 d）下丘脑室旁核GR免疫反应阳性细胞(×400)。    3  讨论

    下丘脑－垂体－肾上腺轴（HPA轴）由下丘脑、垂体、肾上腺组成，三者构成一种级别上的相互协调的反馈调节系统。下丘脑的室旁核（PVN）是HPA轴活动的直接控制部位。当下丘脑接受来自高位中枢信息时，PVN的小细胞神经元分泌多种促进促肾上腺皮质激素分泌的激素，其中最重要的是促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）和精氨酸加压素（AVP）。CRH和AVP经垂体门脉血流到达垂体，并刺激垂体分泌促肾上腺皮质激素（ACTH）；后者经血液循环到达肾上腺，刺激肾上腺皮质合成和分泌糖皮质激素(灵长类动物以皮质醇为主，啮齿类动物以皮质酮为主)。糖皮质激素与皮质类固醇激素受体－盐皮质激素受体（MR）和糖皮质激素受体（GR）结合，反馈作用于垂体和下丘脑构成HPA轴负反馈调节的主要通路［1］。

    MR、GR这两个受体属于核受体家族，他们是能与特异性激素结合的蛋白，主要是一类配基依赖性转录调节因子，通过调节基因表达诱导或者抑制细胞的增殖、分化和死亡，导致多种生物效应。核受体的最大特点是未与激素结合前位于细胞质中，当受体和激素结合后导致受体的活化，活化的受体发生核转位，使受体由细胞质进入细胞核发挥转录调节作用［2］。MR 在中枢的表达比较集中,主要局限在海马、外侧隔核、杏仁核、嗅核、穹窿下器官、下丘脑等区域［3］。GR广泛分布于大脑各区,以边缘系统的海马、隔区、下丘脑最为丰富［4］。

    本实验通过免疫组化技术检测了正常组、假手术组及肾上腺切除0，4，7 d组下丘脑室旁核MR、GR的表达变化。实验结果表明，肾上腺切除后下丘脑室旁核MR的表达无显著变化，而GR表达上调。并且GR的免疫反应阳性产物主要分布在细胞质中。这种结果说明位于下丘脑室旁核的MR可能没有直接涉及HPA轴的调节。曾有报道，海马的MR与糖皮质激素结合，参与HPA轴的负反馈调节，杏仁核、前额皮质的MR与糖皮质激素结合可以激活HPA轴［5］。我们推测MR在各个脑区的作用是不同的，下丘脑室旁核MR与皮质酮结合的作用可能是对水盐摄取和血压的调节。肾上腺切除后GR的表达升高，部分神经元免疫反应阳性物质主要分布在胞质，表明肾上腺切除后糖皮质激素水平下降或缺失导致细胞核内的GR转移到细胞质。这也说明在激素缺失的情况下，GR不能被激活进行转录调节作用。曾有研究报道，肾上腺切除后海马GRmRNA的表达增加，给予较低水平的皮质酮即可阻止GRmRNA的增加［6］，肾上腺切除诱导GR表达的增高很可能是GR基因表达自我调节的结果。

【参考文献】1 De Kloet ER, Vreugdenhil E, Oitzl MS, et al. Brain corticosteroid receptor balance in health and disease［J］. Endocr Rev,1998,19(3):269301.

2 Han F, Ozawa H, Matsuda K, Colocalization of mineralocorticoid receptor and glucocorticoid receptor in the hippocampus and hypothalamus［J］. Neurosci Res,2005,51(4):371381.

3 Arch Gen Psychiatry. Mineralocorticoid receptor function in major depression［J］.Endecr Rev,2003,60(1):2428.

4 张彦慧，韩芳，石玉秀.穹窿切断后海马神经元GR表达变化的研究［J］.中国组织化学与细胞化学杂志，2006，15（6）:581585.

5 Feldman S, Weidenfeld J. The dorsal hippocampus modifies the negative feedback effect of glucocorticoids on theadrenocortical and median eminence CRF41 responses to photic stimulation［J］. Brain Res,1993,614(12):227232.