血管内皮生长因子与糖尿病肾病足细胞损伤的研究进展

作者:王允山,柳方娥,焦波

作者单位：山东大学威海分校国际生物技术研发中心，山东 威海 264209

     【关键词】  血管内皮生长因子； 足细胞; 糖尿病肾病

　　肾病是糖尿病(DM)主要并发症之一。传统上糖尿病肾病(DN)研究主要集中在肾小球系膜细胞损伤机制上，足细胞损伤被认为是由日益增加的蛋白尿所引起的后期病变，而不是导致DN的原因。 然而，最近人体活组织检查研究表明〔1〕，DN发病过程中足细胞功能及结构上的损伤早期已出现。足细胞损伤发生发展过程中一些细胞因子的变化起着重要作用，其中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)与足细胞损伤之间的关系最近成为研究热点，本文拟就DN时VEGF与足细胞损伤的相互关系做一综述。

　　1  足细胞和VEGF概述

　　1.1  足细胞生物学  肾小球滤过膜由脏层上皮细胞、基底膜和内皮细胞组成〔2〕,脏层上皮细胞又称为足细胞,它是一高度分化和特异化的细胞,胞体伸出许多伪足覆盖于肾小球基底膜(glomerular basement membrane，GBM)，称为足突(foot process，FP)，两相邻足突间的裂隙称为裂孔,宽约25～55 nm，靠近GBM之裂孔上覆有裂孔隔膜(slit diaphragm， SD)，其上分布许多小孔，仅可允许水和小分子物质自由透过，大分子物质如血浆蛋白等不能自由通过。因此，SD的完整性是肾小球滤过屏障选择性滤过的主要决定因素之一。足细胞SD上分布多种蛋白，最早发现的是nephrin〔3,4〕，其基因突变发生于芬兰型先天性肾病综合征，是一种罕见的肾脏病变，其特征是弥散性足细胞足突消失。

　　1.2  VEGF概述  VEGF分子质量45 000，是一种二聚体糖基化碱性蛋白，NH2末端有特异的6个极性氨基酸残基组成的疏水基团，是分泌信号的标志。在多种细胞中表达，并且与血管生成相关。不同的外显子剪切编码产生5种形式的VEGF即VEGF121、VEGF145、VEGF165、VEGF189、VEGF206。VEGF在人体内主要分布于足细胞、脉络丛上皮细胞、肝细胞以及具有高代谢及分泌功能的器官组织心脏、骨骼肌细胞、睾丸间质细胞、前列腺上皮细胞、分泌唾液的上皮细胞〔5〕。人体内以VEGF165为最常见，表达最丰富，而且其表达与多种疾病有关。VEGF通过与细胞表面的受体结合而发挥生物学效应〔6〕。研究表明〔7〕在肾小球中，足细胞是产生VEGF最主要的部位，并通过自分泌作用于足细胞使其保持正常的生理功能，肾小球发生病理改变时足细胞表达VEGF也相应发生变化。

　　2  DN足细胞与VEGF

　　2.1  VEGF在足细胞中的生理作用  肾脏形态发育过程中，足细胞分泌的VEGF指导内皮细胞发育成肾小球，肾小球细胞中足细胞是表达VEGF最丰富的细胞，研究表明在生理状态下足细胞不仅分泌VEGF，而且VEGF通过自分泌方式作用于足细胞发挥生理作用。在足细胞分化过程中VEGF的表达也发生着很大的变化，分化的足细胞表达的VEGF量是未分化足细胞的3倍，VEGF mRNA的表达是未分化足细胞的8倍〔8〕。Foster等〔9〕通过VEGF作用于原代培养和条件永生足细胞株培养，检测细胞内钙离子浓度、细胞毒性测定、增殖测定以及细胞计数，结果显示VEGF可以不同程度地降低原代培养足细胞和足细胞株细胞外钙离子浓度，酪氨酸激酶受体抑制剂PTK787/ZK222584可以逆转这一作用。此外，VEGF还可增加足细胞数目、降低细胞毒性，应用VEGF单克隆抗体可以明显增加细胞毒性。电子显微镜观察正常人肾小球发现VEGF主要表达于足细胞细胞膜上，因而在正常肾小球中足细胞分泌的VEGF通过自分泌发挥调节足细胞钙离子平衡，降低足细胞细胞毒性，提高足细胞存活率。新近的研究发现在VEGF促足细胞存活中VEGF-C发挥着重要的作用〔9〕。

　　2.2  VEGF在DN足细胞中的病理作用  在1型和2型DM模型中，VEGF的过量表达均与蛋白尿的生成呈正相关，用VEGF抗体作用于DM模型可以显著降低蛋白尿的排泄。此外，VEGF诱导内皮细胞一氧化氮合酶的生成，进而增加NO浓度促进血管舒张以及超滤过。最近研究表明〔10〕足细胞分泌的VEGF通过自分泌作用使足细胞Ⅳ型胶原分泌增加，用TGF-β1刺激体外培养的足细胞表达VEGF，升高的VEGF可以导致足细胞分泌Ⅳ型胶原α3链的量增大，用特异性VEGF受体激酶抑制剂SU5416阻断VEGF活动可以使Ⅳ型胶原α3链的生成减少50%。体内研究结果也表明VEGF可以导致Ⅳ型胶原分泌增加、GBM增厚，DM小鼠腹腔注射SU5416，2 mg/kg，1 w 2次，连续8 w。SU5416处理后可以防止GBM增厚和蛋白尿发生，但对血糖水平无影响〔10〕。DN蛋白尿的发生和其滤过屏障通透性的改变有着必然的联系，DN时肾小球足细胞VEGF分泌增加，增加的VEGF诱导Ⅳ型胶原分泌增加最终导致GBM增厚，理论上GBM增厚会使滤过屏障更有效，蛋白尿应该减少，然而在Ⅳ型胶原分泌增加导致GBM增厚的过程中Ⅳ型胶原的组成和结构均发生了改变，形成了更多的孔以利于大分子物质通过〔11〕。因此在DN足细胞中过量表达的VEGF在蛋白尿形成中起发挥着重要作用。

2.3  DN足细胞VEGF分泌的调节

　　2.3.1  高糖对VEGF的调节作用  DN状态下，肾小球局部的高糖环境对肾小球足细胞功能有重要影响，高糖可以引起足细胞生理功能发生变化，使其分泌VEGF能力增强，使肾小球局部VEGF浓度升高。最近研究发现〔12,13〕，高糖状态培养的足细胞其VEGF及mRNA表达水平均增高，进一步研究发现高糖状态下足细胞分泌VEGF是通过蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)、细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)介导，PKC、ERK的诱导剂(12-)十四酸佛波酯(-13-)乙酸盐(PMA)可以激活AP-1依赖性转录，上调VEGF表达。同时在高糖状态下应用PKC抑制剂GF10902X和ERK激酶抑制剂PD98059可以逆转高糖引起的VEGF高表达。在DN的病理过程中PKC、ERK介导的VEGF高表达可能是蛋白尿产生的因素之一。

　　2.3.2  血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)对VEGF的调节作用  AngⅡ和VEGF在DN发病机制中发挥着重要的作用，在肾小球足细胞中AngⅡ通过一系列级联反应最终诱导VEGF高表达。Kang等〔14〕研究表明，在培养的足细胞中加入AngⅡ可以导致VEGF 蛋白及其mRNA表达急剧增加，且呈剂量依赖性。给与氯沙坦能显著抑制AngⅡ诱导的VEGF mRNA合成及蛋白表达，表明AT1 受体与AngⅡ介导的VEGF合成相关。此外，足细胞在AngⅡ刺激下磷酸化p38MAPK和MKK3/6均增加,进一步增强cAMP效应元件结合蛋白(cAMP response element binding protein，CREB)黏附DNA的活力以及磷酸化CREB。足细胞用p38MAPK抑制剂(SB203580)预处理24 h,以观察AngⅡ介导的VEGF合成能否通过阻断p38MAPK而被抑制，加入SB203580导致AngⅡ诱导VEGF mRNA表达被显著地抑制。综上所述，AngⅡ刺激足细胞VEGF合成，这个过程部分是由p38MAPK通路介导。

　　2.3.3  晚期糖基化终末产物受体(RAGE)对VEGF的调节作用  DN时AGEs增加，肾小球足细胞RAGE活力增强可以引起VEGF表达增多，Wendt等〔15〕研究发现遗传性DM db/db小鼠13 w时其足细胞RAGE表达增多，此时足细胞VEGF表达也增多，用RAGE抑制剂阻断RAGE时可以降低VEGF的表达。27 w时给予db/db小鼠可溶性RAGE，可以使蛋白尿减少、肾小球硬化减轻及肾功能改善。DM纯合型RAGE缺失小鼠不能最终发育成系膜基质扩张、基底膜增厚。因此，DN时足细胞RAGE的活性增高可能是导致VEGF表达增多的原因之一。

　　2.3.4  ROS(ROS)对VEGF的调节作用  ROS浓度增加在DM并发症中发挥着起始的作用，各种实验性肾小球疾病中足细胞释放的ROS在肾小球病理损伤中发挥着重要的作用。最近Lee等〔16〕通过体外培养足细胞研究发现，高糖导致足细胞ROS水平增高、VEGF表达增加。在应用抗氧化剂处理高糖刺激的足细胞后，升高的VEGF被明显抑制，因此VEGF高表达与ROS增加有关，ROS浓度增加可以诱导VEGF高表达。

　　2.3.5  其他细胞因子对VEGF的调节作用  肾小球基底膜中的一些细胞因子在调节足细胞表达VEGF中也发挥着一定的作用，Datta等〔17〕研究发现肾小球基底膜中的层黏连蛋白(laminin，LN)及其受体α3β1整合素在体外培养的足细胞中均可增加VEGF表达。LN及其受体对足细胞VEGF表达的调节是通过激活低氧诱导因子-α(hypoxia-inducible factor-alpha，HIF-α)而实现的，HIF-α是一种转录活化因子且其诱导的VEGF转录增强与缺氧无关。DN时SLM-2对肾脏VEGF表达也有一定影响，S样哺乳动物蛋白(SLM)-2蛋白属于信号转导与RNA活化蛋白(STAR)家族，其主要功能是RNA转录后加工，正常状态下肾脏中有SLM-2蛋白表达且局限于肾小球足细胞。研究发现〔18〕，蛋白尿发病时足细胞表达的SLM-2蛋白及其mRNA量均明显升高。应用基因敲除技术敲除SLM-2基因，使得VEGF RNA剪接不能正常发生，最终导致VEGF表达减少。在体内，SLM-2的表达高低和VEGF表达呈正相关性，抑制SLM-2表达VEGF生成将会减少，反之DN时SLM-2高表达导致VEGF水平升高。

2.4  VEGF与足细胞特异因子的相互作用

　　2.4.1  VEGF与nephrin的相互作用  nephrin是足细胞隔膜裂孔上的一种细胞黏附因子，在保持肾小球的滤过屏障功能完整性上发挥着重要的作用。nephrin不仅在蛋白尿的形成中起着关键作用，而且在足细胞的存活中也发挥着重要作用，在足细胞中nephrin 与VEGF相互作用减少足细胞的凋亡。Foster等〔19〕研究发现，VEGF可以降低细胞毒性减少细胞凋亡，流式细胞仪检测nephrin突变的足细胞细胞凋亡显著增加，尽管VEGF可以减少足细胞凋亡，但对于nephrin有缺陷的足细胞其抗凋亡功能却不能发挥。进一步研究发现VEGF抗凋亡作用的发挥依赖于nephrin的完整性，VEGF刺激nephrin磷酸化而发挥抗凋亡作用。DN时nephrin丢失导致VEGF抗凋亡功能减弱，足细胞凋亡增加，滤过屏障受损，可能是导致蛋白尿发生的原因之一〔20〕。DN时足细胞VEGF表达虽增高，但nephrin表达减少而导致其抗凋亡功能减弱。

　　2.4.2  VEGF与podocin和CD2AP的相互作用  podocin和CD2AP均是新近发现的足细胞隔膜裂孔蛋白，podocin与nephrin胞内段羧基末端及CD2AP相互作用形成蛋白复合体, 介导SD与足细胞骨架相连。podocin具有离子通道及感受SD滤过压力的功能，足突动力学的改变可以调整SD的滤过通透性, 研究发现这与podocin参与改变SD总滤过面积和滤过筛孔的大小有关〔21〕。此外,podocin、CD2AP 和nephrin组成的复合体在维持SD结构完整性上起了重要作用。最近研究结果显示〔22〕在生理状态下VEGF可以上调podocin的表达，增加podocin与CD2AP的相互作用，调节隔膜裂孔蛋白表达，改善滤过屏障功能。但在DN状态下VEGF高度表达，其主要病理作用是增加滤过屏障的通透性。

　　3  结语    　　理想的治疗DN的方法目前仍在研究中，但是良好的血糖控制以及拮抗AngⅡ已经成为当今治疗的基础。有希望成为治疗靶点的TGF-β1、nephrin、硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPG)、糖化蛋白以及ROS已经开始受到重视。干扰VEGF与足细胞的相互作用在治疗DN中也将会发挥重要作用。

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