选择性垂体甲状腺激素抵抗综合征患者的临床特点与THRβ基因突变的研究
发表时间：2009-11-25 浏览次数：595次
作者：施秉银，梁静 作者单位：西安交通大学第一附属医院内分泌科，陕西西安 710061
【摘要】 目的 研究2例选择性垂体甲状腺激素抵抗综合征患者的临床特点及甲状腺激素受体β(THRβ)基因突变，探索该病的发病机制。方法 收集2例患者及其父母的临床资料并留取外周血标本，提取基因组DNA，应用PCRDNA直接测序的方法研究患者及父母的THRβ基因有无突变。结果 2例患者及父母的THRβ基因第1-10外显子未发现突变。结论 散发性垂体甲状腺激素抵抗综合征患者发病可能与THRβ基因突变无关。
【关键词】 激素抵抗；甲状腺激素受体；基因；突变
Clinical and THRβ gene mutation study on pituitarythyroid hormone resistance syndrome
Shi Bingyin, Liang Jing
(Department of Endocrinology, the First Affiliated Hospital,Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710061, China)ABSTRACT: Objective To study the clinical and THRβgene mutation of two cases of pituitary thyroid hormone resistance. Methods The clinical data and peripheral blood samples of the patients and their family members were collected, and then DNA was isolated. PCR and direct sequencing techniques were performed to determine if there were mutations in their THRβgene. Results No mutation was found in exon 1-10. Conclusion Pathogenesis of sporadic pituitary resistance to thyroid hormone usually has no relation with mutation of THRβgene.
KEY WORDS: hormone resistance; thyroid hormone receptor; gene; mutation
甲状腺激素抵抗综合征(thyroid hormone resistance syndrome, THRS)是由于甲状腺作用的靶器官对甲状腺激素的反应性降低而引起的一种常染色体显性遗传性疾病，血清游离T3(FT3)和/或游离T4(FT4)升高，同时伴有不适当正常或升高的血清促甲状腺激素(TSH)水平是该病的典型生化特征[1]。以家族性发病多见，有大约15%的散发病例。自1967年Refetoff等[2]报道第一例患者以来，目前已经发现了250多个家系，700多例患者[34]。国内近年来也有病例报道[5]。国内外的研究者从分子遗传学、分子生物学和内分泌学等多侧面对这些病例进行了研究。1988年Usala等[6]通过限制性片段长度多态性分析证实该病与甲状腺激素受体β(THRβ)基因突变有关。截止目前仅有几例散发的THRS病例报道。
本研究采用聚合酶链反应(PCR)DNA直接测序的方法，检测我院门诊2例选择性垂体甲状腺激素抵抗综合征(pituitary resistance to thyroid hormone, PRTH)患者及其父母的THRβ基因突变率最高的1-10外显子，并结合临床特点，从分子水平探讨该病的发病机制。
1 资料与方法
1.1 临床资料
患者1，女性，29岁，因“听力下降27年，怕热、多汗、心悸3年”就诊。患者于2岁时因“发热、咳嗽”诊断为肺炎，经治疗后上述症状缓解。但逐渐出现双耳听力下降，以左侧为著，伴有语言障碍，发音不清，电测听检查提示“感音神经性耳聋”，治疗后无好转。 3年前体检时发现甲状腺肿大，伴有轻微怕热、多汗、心悸，大便次数增多，每日2-3次，无多食、消瘦，外院化验血清TT3 473ng/dL(参考值65-240ng/dL)，TT4 27.5μg/dL(参考值5.5-13μg/dL)，FT3 14.5pmol/L(参考值2.8-8.5pmol/L)，FT4 50.3pmol/L(参考值9.5-26.5pmol/L)，TSH 10.4μIU/mL(参考值<10μIU/mL)诊断为“甲状腺功能亢进症”，服用他巴唑30mg/d治疗，半年后上述症状仍无缓解，TSH一直高于正常。以后曾在多家医院就诊，反复调整他巴唑的剂量(10-15mg/d)，甲状腺功能检查一直未能恢复正常，为进一步诊治，于2004年6月来我院就诊。家族中无类似病史。 发病以来，生长发育及智力正常。11岁月经初潮，经期不规律。体格检查：体温36.5℃，呼吸20次/min，脉搏100次/min，血压120/75mmHg(1mmHg=0.133kPa)，身高163cm，体重56kg，发育正常，营养中等，查体合作，发音不清。左耳听力丧失，右耳听力严重下降，无Graves病眼征，甲状腺Ⅱ度肿大，质软，无结节，无压痛，无震颤及血管杂音。其他检查无异常发现。 辅助检查：血、尿、粪常规正常，血糖、肝肾功、血浆蛋白均正常，甲状腺球蛋白抗体TGAb 1.9%(正常<30%)，甲状腺微粒体抗体TMAb 1.0%(正常<20%)，HCG<1mIU/mL(正常值<5mIU/mL)，FSH、LH、E、P均正常。头颅及蝶鞍MRI正常。甲状腺扫描示甲状腺弥漫性肿大。患者来我院后停用他巴唑1月，然后行T3抑制试验[7](自实验第1天起每天给予患者LT3口服，并逐渐增加LT3的剂量，由50μg/d增至100μg/d和200μg/d，每一剂量持续3d，在实验前及每一剂量应用3d后，分别测定甲状腺功能、血清胆固醇、甘油三酯、铁蛋白、肌酸磷酸激酶、泌乳素、24h尿氮、心率和基础代谢率(BMR)(表1)。其父母甲状腺功能测定正常。表1 T3抑制试验的结果（略）
之后试用三碘甲状腺乙酸(TRIAC)治疗半年后，月经逐渐恢复正常，甲功结果检测：FT4：54.9pmol/L；FT3：25.3pmol/L；hTSH：5.26μIU/mL，第6个月FT4：54.9pmol/L；FT3：15.9pmol/L；hTSH：6.59μIU/mL。 患者2，女性，18岁，因“多汗心悸2年”就诊，两年前无明显诱因出现发热，体温波动于38-39℃，自觉心悸，在包头医学院第三附属医院住院，经治疗后，发热消失，但心悸无明显缓解同时伴有多汗。后转至该院儿科继续治疗，查心肌酶谱正常，ECG示窦性心动过速，甲功提示FT3：8.8pmol/L(参考值：3.2-9.6pmol/L)，FT4：16pmol/L(参考值：8.6-25.8pmol/L)，hTSH：1.93(参考值：0.35-5.5pmol/L)，未给特殊治疗。两月后，再次复查甲功，FT3、FT4均升高，hTSH正常(FT3：16pmol/L，FT4：>200pmol/L，hTSH：2.1)，诊断为“甲亢”服用他巴唑30mg/d治疗，半年后自行减至25mg/d，后逐步减量，四个月后减为5mg，并加用甲状腺素片20mg/d，甲状腺素片服用两月后停用，以后一直服用他巴唑5mg/d治疗，一年后改服“富马酸比索络尔”5mg/d至今。期间症状时好时坏，曾在多家医院就诊，甲状腺功能检查一直未能恢复正常，为进一步诊治，于2005年6月来我院就诊。家族中无类似疾病史。 自发病以来，生长发育及智力正常。11岁月经初潮，经期不规律。体格检查：体温36.5℃，呼吸20次/min，脉搏92次/min，血压120/80mmHg，身高164cm，体重57.5kg，发育正常，营养中等，查体合作，发音不清。无Graves病眼征，甲状腺Ⅱ度肿大，质软，无结节，无压痛，无震颤及血管杂音。其他检查无异常发现。 辅助检查：血、尿、粪常规正常，血糖、肝肾功、血浆蛋白均正常。甲功结果检测：FT3：11.28pmol/L；FT4：22.01pmol/L；hTSH：8.43μIU/mL，甲状腺B超：甲状腺轻度肿大，实质回声均匀；甲状腺ECT示：甲状腺显影清晰，位置正常，形态增大，甲状腺影像放射性分布均匀，对称。垂体MRI检查正常。其父母甲状腺功能测定正常。
1.2 方法
1.2.1 外周血基因组DNA抽提
抽取2例患者及其父母、5名健康对照的静脉血各5mL，以复方枸橼酸钠(ACD)抗凝，盐析法提取外周血白细胞基因组DNA，用TE缓冲液溶解，以紫外分光光度仪测定各DNA样品的纯度和浓度。
1.2.2 聚合酶链反应
PCR以各DNA样品为模板，用Primer 5.0软件对THRβ基因的10个外显子分别设计引物，由上海生工公司合成(表2)，并用双蒸水溶解，各引物浓度为10pmol/μL，PCR反应体系如下：Taq Mix(北京天为时代)25μL，DNA模板1μL，上游和下游引物各1μL，用双蒸水补足体积至50μL。反应条件为：预变性95℃，5min；变性94℃，30s；退火温度，30s；延伸温度见表2，30s，30个循后72℃延伸7min，PCR产物4℃保存。表2 THRβ基因的10个外显子的引物序列和PCR反应产物的长度（略）
1.2.3 PCR产物电泳
各取5μL PCR反应产物在含溴乙锭的15g/L琼脂糖凝胶上电泳，在紫外灯下观察。
1.2.4 PCR产物分析
1-10号外显子PCR产物送北京奥科生物技术有限公司，采用Qiaex Gel Extraction kit (Qiagen)纯化，ABI377自动测序仪进行测序，用BLAST软件将所测得的序列分别与GenBank提供的各外显子序列进行比对,寻找突变位点。
2 结果 2例患者及其父母、5名健康对照THRβ基因1-10外显子PCR产物电泳结果显示大小均符合所设计引物序列的扩增长度，未见异常扩增条带(图1)。 上述成员的1-10号外显子PCR产物经纯化、测序，并与GenBank提供的THRβ基因第1-10号外显子序列进行对比，未发现突变位点。
3 讨论 THRS是由于垂体在内的靶器官对TH的反应性下降而引起的一种疾病。根据对TH不敏感的组织分布，THRS可分为全身型甲状腺激素抵抗(generalized resistance to thyroid hormone, GRTH)、选择性垂体甲状腺激素抵抗(pituitary resistance to thyroid hormone, PRTH)和选择性外周甲状腺激素抵抗(peripheral resistance to thyroid hormone, perRTH)三种类型。 甲状腺激素抵抗综合征临床表现复杂多变，有的表现为甲亢，有的表现为甲减，有的无任何临床表现，部分患者甚至可能同时出现甲亢或甲减的症状或体征。因此，临床上极易漏诊或误诊。该研究中的2名先证者先后曾在多家医院就诊，均被误诊为甲状腺功能亢进症，给予抗甲状腺激素药物治疗，结果甲状腺激素水平无明显下降，而TSH反而更加升高。而1名患者因为无症状一直未被发现，说明在我国仍有许多医生对该病的认识不足，需要提高对该病的认识和诊断水平。 本研究中的2名患者都具有甲状腺功能亢进的临床表现，垂体MRI未见异常，甲状腺肿大，多次检查提示血清TH水平升高。但TSH水平正常或升高，TGAb、TMAb及TsAb等自身抗体均阴性。因此，可排除Graves甲亢和垂体TSH分泌瘤，第1例患者给予外源性LT3口服后，替代剂量的T3(50-100μg/d)不能抑制TSH，超生理剂量的T3(200μg/d)可以部分抑制TSH的合成和分泌(TSH降至基础值的73.2%)。患者基础代谢率升高，基础的脉搏以及TH外周作用标记物，如血脂、肌酸磷酸激酶、铁蛋白及24h尿素氮均正常，当给予超生理剂量的T3(200μg/d)口服后，基础代谢率明显升高，心率加快，胆固醇及肌酸磷酸激酶降低，铁蛋白显著升高(>基础值367.5%)，24h尿素氮升高，心悸加重，烦躁，说明外周组织对TH的反应正常。因此，符合PRTH的诊断。第2例患者以甲状腺肿大、甲状腺功能亢进为主要临床表现，垂体MRI未见异常，两年来多次随访甲状腺功能检查均提示TT4、FT4升高，uTSH正常或升高，给予LT4治疗2年，疗效欠佳，甲状腺功能检查均未恢复正常。临床符合PRTH的诊断。 PRTH 1975年由Gershengorn首次报道，目前已发现了70多例患者，有家族性发病的，也有散发的。仅垂体对TH抵抗，而外周组织对它敏感。垂体对TH抵抗，正常范围的TH就不能抑制TSH分泌，结果TSH增高以刺激甲状腺分泌，患者多有甲状腺毒症的临床表现。甲亢的病情为轻至中度，无突眼、黏液性水肿等临床表现。 目前，世界范围内对GRTH的研究较为深入。但对PRTH的发病机制尚不十分清楚。1993年Mixson等[8]对该家系患者进行基因分析，在THRβ基因第9外显子上发现一错义突变位点(1297C→T)。以后又发现了一些PRTH患者THRβ基因存在突变，而且有几个THRβ基因突变位点明显倾向于发生PRTH，如R338W、R338L、R429Q、R383H，其机制尚不十分清楚，可能与这些突变型受体仅对负调控基因(如TRH、TSH)有优势负性作用有关。迄今为止，大多数学者认为PRTH也是一种与TR基因突变有关的遗传性疾病。但是，近年来人们发现仍有大约10%-15%的PRTH患者THRβ基因并未发现突变。Hamon B等[9]报道了1例PRTH患者与本研究中的患者具有相似的临床表现及血清学结果，进行了THRβ基因的检测，但未发现突变。与本研究的结果一致。对于少数THRβ基因无突变的患者，可能与受体后缺陷或垂体Ⅱ型5′脱碘酶缺乏等因素有关，其中辅助调节因子异常与甲状腺激素抵抗的关系倍受国外研究者的关注[10]。 辅助调节因子是一组参与调节核受体转录活性的蛋白质。它们与各种核受体相互作用，对于核受体发挥转录调控作用具有重要的意义。9顺式视黄酸受体(RXR)也是核受体家族的一员，在THR受体介导的转录调节过程中具有重要的作用。研究发现RXRγ基因缺乏的小鼠血清T4及TSH水平升高，外源性T3不能抑制TSH的水平。同时，这些小鼠的基础代谢率显著升高，说明他们存在中枢性甲状腺激素抵抗[1112]。缺乏核受体辅助因子(NcoA1/SRC1)的小鼠也出现了与甲状腺激素抵抗患者相似的临床表现，而且正如甲状腺激素抵抗患者，这种小鼠给予外源性T3后并不能抑制TSH合成和分泌，说明垂体对甲状腺激素的反应性下降。Reutrakul等[13]在THRβ基因无突变的6个RTH家系中，研究了5种辅助调节因子(SRC1、NCoA3、NCo R、SMRT、RXRγ)，发现其中两个家系存在RXRγ基因异常。 目前，对PRTH的治疗主要是以药物治疗为主，目的是既抑制TSH的分泌，又不能加重甲状腺毒症。三碘甲状腺乙酸(TRLAC)是目前世界范围内公认的治疗PRTH患者疗效较确切的药物。本研究中第1例患者口服TRLAC 0.375mg，每日一次，治疗半年，甲状腺无明显的缩小，血清TSH水平无显著改变，其原因可能是由于患者在垂体水平存在较严重的甲状腺激素抵抗(T3抑制实验中，200μg/d T3仅能使TSH由3.1μIU/mL降至2.27μIU/mL)，也与TRLAC用药剂量不足、用药时间较短等原因有关。 PRTH的发病机制目前尚不清楚，其可能的机制主要是除了调节因子的异常，其次THRβ mRNA转录后的拼接以及其后的蛋白质翻译加工过程中是否存在异常、T3介导的基因转录过程中一些辅助因子是否存在缺陷等尚有待于进一步研究。
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