少精不育患者体细胞与精细胞的雄性激素受体基因突变的比较与分析
发表时间：2009-11-26 浏览次数：629次
作者：王建勋 叶锋 袁汉尧 （广东医学院附属医院 中心实验室 检验科， 湛江 ５２４００１）
【关键词】 基因突变；少精液症；不育；雄激素受体；
摘要 目的：了解雄性激素受体基因（Ａｎｄｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｇｅｎｅ）突变对少精不育病症发生所起的作用及突变的来源。方法：利用ＰＣＲ对４５例精液标本和配对的血液标本ＡＲ基因８个外显子分别进行扩增。扩增产物经琼脂糖电泳和聚丙烯胺的ＣＤＧＥ电泳分析，检测基因片段的插入和缺失及点突变。结果：４５例少精不育患者的精液标本中，外显子Ａ即基因转录激活区发生点突变者３例，插入突变４例，缺失突变３例共１０例，占２２．２％；外显子Ｈ发生缺失突变１例、外显子Ｇ处发生点突变１例、外显子Ｅ发生完全缺失突变１例、不完全缺失突变１例；同时他们的血液标本中，只有３例在外显子Ａ发生插入突变。结论：雄性激素受体基因外显子Ａ即基因转录激活区的突变是造成少精不育的重要原因。突变一般发生在减数分裂期，少数是亲代遗传。
关键词 基因突变；少精液症；不育；雄激素受体；
Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｏｆ ａｎｄｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｇｅｎｅ ｉｎ ｓｏｍａｔｉｃ ｃｅｌｌ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈａｔ ｏｆ ｓｐｅｒｍａｔｏｂｌａｓｔ ｉｎ ｉｎｆｅｒｔｉｌｅ ｍｅｎ ｗｉｔｈ ｏｌｉｇｏｓｐｅｒｍｉａ
Ｗａｎｇ Ｊｉａｎｘｕｎ，Ｙｅ Ｆｅｎｇ，Ｙｕａｎ Ｈａｎｙａｏ
（ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｅｎｔｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ ，Ｚｈａｎｊｉａｎｇ ５２４００１）
Ａｂｓｔｒａｃｔ ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｗｈａｔ ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｉｓ ｏｆ ａｎｄｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｇｅｎｅ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｉｎｆｅｒｔｉｌｅ ｍｅｎ ｗｉｔｈ ｏｌｉｇｏｓｐｅｒｍｉａ，ａｎｄ ｗｈｅｒｅ ｔｈｅ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｃｏｍｅ ｆｒｏｍ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｅａｃｈ ｅｘｏｎ ｏｆ ＡＲ ｇｅｎｅ ｗａｓ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｂｙ ＰＣＲ， ｗｉｔｈ １２ ｐａｉｒ ｐｒｉｍｅｒｓ ｆｒｏｍ ４５ ｐａｔｉｅｎｔｓ，ａｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ａｒｅ ｓｅｐａｒａｔｅｄ ｂｙ ａｇａｒｏｓｅ ａｎｄ ＣＤＧＥ（ｃｏｎｓｔａｎｔ ｄｅｎａｔｕｒｅｄ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ），ｓｏ ｔｈａｔ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ，ｄｅｌｅｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｃａｎ ｂｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｔｈｅ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｅｘｏｎ Ａ ｏｆ ＡＲ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ ４５ ｓｐｅｒｍ ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ ｉｓ ｔｗｅｌｖｅ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ ３ ｃａｓｅｓ，ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ｍｕｔａｔｉｏｎ ４ ｃａｓｅｓ ａｎｄ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｍｕｔａｔｉｏｎ ３ ｃａｓｅｓ，ｔｈｅ ｒａｔｅ ｏｆ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｓ ２６．７％．Ｔｈｅ ｃａｓｅｓ ｏｆ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｂｌｏｏｄ ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ ａｒｅ ｔｈｒｅｅ，ａｎｄｊｕｓｔ ｌｏｃａｔｅｄ ｉｎ Ｅｘｏｎ Ａ．Ｔｈｅ ｍｕｔａｔａｎｔ ｒａｔｅ ｉｓ ６．７％． Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｍｕｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｘｏｎ Ａ ｉｎ ＡＲ ｇｅｎｅ ｐｌａｙｓ ａ ｖｅｒｙ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｐａｒｔ ｉｎ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｉｎｆｅｒｔｉｌｅ ｍｅｎ ｗｉｔｈ ｏｌｉｇｏｓｐｅｒｍｉａ．Ｓｏｍｅ ｏｆ ｔｈｅｍ ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ ｆｒｏｍ ｐａｒｅｎｔｓ．
Ｋｅｙ Ｗｏｒｄｓ：ｇｅｎｅ ｍｕｔａｔｉｏｎ；ｉｎｆｅｒｔｉｌｅ ｗｉｔｈ ｏｌｉｇｏｓｐｅｒｍｉａ；ａｎｄｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｇｅｎｅ；ａｎｄｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ
雄激素受体（ＡＲ）的存在是正常男性性征的分化，睾丸的发育和精子产生的必要条件［１］。蛋白质研究表明约４０％的不育男人有ＡＲ反常现象［３］。ＡＲ基因的突变可以导致细胞对睾酮敏感性降低，从而引起４６．ＸＹ的男性个体表型发育的反常，体现在从完全女性化到部分体征女性化不等。ＡＲ变异研究一般表现为四个方面：受体结合区的缺失，受体数量的减少，受体质的异常及受体阳性雄激素抗性［２］。本实是用现代分子生物学技术检测ＡＲ基因突变与不育的关系。
１ 材料和方法
１．１ 材料
１．１．１ 标本收集 精液标本均来自本院检验科共收集４５例，是婚后２～３ ａ不育的病人，经ＳＱＡ检测为少精，精子形态正常在４５％以下，活率在３０％～６０％之间。同时抽血一份，分离白细胞，作对比分析。
１．１．２ 主要试剂和仪器及来源 Ｔａｑ酶、饱和酚、琼脂糖、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、ＴＥＭＥＤ、过硫酸胺、尿素等购自ＧＩＢＣＯＢＲＬ公司；蛋白酶Ｋ、ＳＤＳ购自ＳＩＧＭＡ公司；点突变检测仪、水平和垂直板电泳槽、电泳仪、成像系统（Ｉｍａｇｅ Ｓｙｓｔｅｍ Ｇｅｌ ＤＣ １ ０００）购自ＢｉｏＲａｄ公司；高速低温离心机购自ＢＥＣＫＭＡＮ公司；ＰＣＲ扩增仪购自Ｔｈｅｒｍｏｌｙｎｅ公司。
１．２ 方法
１．２．１ ＤＮＡ的抽提 用一般经典方法酚氯仿抽提法，即１５ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心收集精细胞和白细胞，用ＳＤＳ、蛋白酶Ｋ在５６°Ｃ条件下消化３ ｈ，再分别用酚、酚：氯仿、氯仿各抽提一次，用２倍无水乙醇沉淀干燥ＤＮＡ，用ＴＥ溶解保存，紫外光下测吸光度（Ａ）值。
１．２．２ ＰＣＲ扩增 分别扩增来自精液标本和血液标本的ＤＮＡ ＰＣＲ扩增的引物按文献设计［４］，共１２对引物扩增８个外显子。由北京赛百盛公司合成，引物序列见表１其中外显子Ａ为转录激活区，因较长，故选用５对引物来分段扩增。扩增条件：１ μＭ引物，２００ μＭ ｄＮＴＰｓ，２ Ｕ Ｔａｑ聚合酶，２００ ｎｇ ＤＮＡ模板，３ μＬ １０×扩增缓冲液，反应体积为３０ μＬ，在９４°Ｃ ４５ ｓ，５８°Ｃ ４５ ｓ，７２°Ｃ ５０ ｓ条件下共３５个循环。ＰＣＲ产物在１．８％琼脂糖凝胶电泳９０ ｍｉｎ，溴化乙锭染色２０ ｍｉｎ，在紫外成像系统中拍照。
表１ ＡＲ基因８个外显子扩增引物序列（略）
１．２．３ 插入和缺失突变分析 在琼脂糖凝胶电泳中，如果标本的扩增片段大于正常的，说明是插入突变；若小于正常，则为缺失突变。
１．２．４ 点突变分析 利用ＢｉｏＲａｄ公司生产的单碱基突变检测系统（Ｄｃｏｄｅ）对ＰＣＲ扩增产物作均一变性凝胶电泳（ＣＤＧＥ，ｃｏｎｓｔａｎｔ ｄｅｎａｔｕｒｅｄ ｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）分析。即在１０％ＰＡＧＥ（聚丙烯酰胺凝胶电泳）中加入尿素，使其到达５１％的变性度。电泳缓冲液为１×ＴＡＥ，在５６°Ｃ条件，用１３０ Ｖ电压，电泳３ ｈ。然后溴化乙锭染液浸泡２０ ｍｉｎ，取凝胶置于成像系统（Ｉｍａｇｅ ｓｙｓｔｅｍ ＤＣ １ ０００）中摄影拍照。在ＤＮＡ分子量大小一致的情况下，正常的带在前面，突变型带则滞后落在后面，若既有突变型又有野生型的ＤＮＡ带，则分开为两条带。
２ 结果
２．１ 雄性激素受体（ＡＲ）基因外显子的插入和缺失突变分析 利用设计好的引物扩增外显子Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ。在此４５ 例病人的精液标本中，３例外显子Ａ、１例外显子Ｅ，共４例发生完全缺失突变，发生不完全缺失突变的是外显子Ｈ １个，外显子Ｅ １个，还有４例标本的部分精细胞在外显子Ａ处发生插入突变；同时病人的血液标本中，仅在外显子Ａ处发生３例插入突变，没有缺失突变。（见图１，２）
Ｍ分子量标记５，７，９，１１精液标本扩增野生型１精标本不完全缺失突变３完全缺失突变２，４，６，８，１０，１２血液标本扩增野生型
图１ ＡＲ基因外显子Ｅ扩增（略）
Ｍ分子量标记１，５，９血液标本扩增插入突变４，７血液标本野生型６，１０精标本插入突变２，３，８精液标本扩增缺失突变
图２ ＡＲ基因外显子Ａ ２扩增（略）
２．２ 雄性激素受体基因的点突变 为了确定ＡＲ基因的点突变是否存在，用ＣＤＧＥ技术来检测同样批标本的同一次ＰＣＲ扩增产物。如果发生点突变，即便分子量大小一样，野生型ＤＮＡ带在电泳中走得快，而突变型带在电泳胶中走得慢，因而可分区出哪一个标本中含有点突变的带。在此４５例精液标本中，外显子Ａ ３引物扩增产物经ＣＤＧＥ电泳分离，３例见有点突变，在外显子Ｇ处，发现１例点突变，其他外显子未发现点突变（见图３）；在血液标本中未见点突变。 １，２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１外显子Ｅ野生型
１２，１３，１４外显子Ａ扩增点突变
图３ ＡＲ基因外显子点突变ＣＤＧＥ图（略）
２．３ 精细胞和体细胞中ＡＲ突变的比较 在４５例病人的标本中，精细胞和体细胞同时发生插入突变的有２例，如图２的５号和６号、９号和１０号；另有１例体细胞发生插入突变而精细胞却为缺失突变，如图２的１号和２号；其他的突变均发生在精细胞上，体细胞未见异常。经统计，精细胞群体中ＡＲ基因的总突变率为２６．７％，体细胞群体总突变率为６．７％。
３ 讨论
ＡＲ基因是位于Ｘ染色体上的基因，落于端粒和ｑ １３之间，共有８个外显子Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ。其中Ａ是转录激活区，Ｂ、Ｃ是ＤＮＡ结合区，Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ是配体结合区。ＡＲ基因编码的ＡＲ蛋白是核蛋白，可直接与ＤＮＡ结合，从而调节其它基因的表达［４，６］。外显子Ｂ和Ｃ是极度保守的，编码两锌指元件，形成ＤＮＡ结合区［７］。外显子Ａ不仅具有转录激活功能而且还可以调节ＤＮＡ结合区［８］。Ａ、Ｂ、Ｃ外显子显然均不能影响配体的结和。外显子Ｄ序列整个保守性较差，但在所有的核受体中，它有一段极为保守的２３氨基的序列，突变实验表明，其可能是配体结合区疏水区的一部份［４］。如果外显子Ｄ、Ｇ有一系列的缺失或插入突变的发生，将会导致受体结合和转录活性的减少［４］。外显子Ｇ突变可以既影响受体结合区又可以影响到ＡＲ蛋白的转录激活区，从而影响到整个ＡＲ的活性。外显子Ｈ编码的是配体结合区，其突变会导致配体结合区的亲和力，从而降低细胞对激素的敏感性
雄性激素不敏感综合征（ＡＩＳ）是由于ＡＲ缺陷引起的。Ａｉｍａｎ等［３］认为完全或部分精子发生障碍也是ＡＲ缺陷引起的，在其的实验中发现，２２个少精者中有９个的ＡＲ亲合力明显降低，所以他认为４０％少精或精子无功能的不育症患者具有某种程度的ＡＲ不敏感性。Ｂｏｕｅｃｈａｒｄ等［５］认为在一部分少精不育患者中，其ＡＲ结合亲合受体能力并没有降低但却具有ＡＩＳ特征，说明除了结合突变可引起ＡＩＳ，基因的其它的突变也可引起ＡＩＳ。
转录激活区的突变可能会影响基因的分化表达，引起个体表型发育为正常男性而男性性功能却有损伤，如精子的发生等，如Ｋｅｎｅｄｙ病是一种ｘ链锁的疾病，会引其严重的少精症及肌萎症。这种病最近被认为就是因为ＡＲ基因外显子Ａ内有个三核苷重复序列（ＣＡＧ ｒｅｐｅａｔｓ）。在外显子Ａ一共有１２０到１５６个多余的核苷酸插入到基因组中，引起插入突变转译为蛋白质后，此段多出４０到５２个氨基酸，从而影响到ＡＤ转录区的激活功能［１０，１］。
本实验发现：在４５例精液标本中发生突变的有１２例，突变率为２６．７％，其中Ａ外显子发生点突变３例，插入突变２例，缺失突变３例。外显子Ｈ发生１例小片段缺失突变，外显子Ｇ发生１例点突变，外显子Ｅ发生完全缺失突变 １例，不完全缺失突变１例，其它外显子均未发现异常变化。而在４５例血液标本中３例发生插入突变且都发生在外显子Ａ上，突变率为６．７％。说明少精或精子无活力不育患者主要原因是精母细胞的ＡＲ基因在减数分列突变引起的，少数患者是父母遗传的。
外显子Ａ的突变显然会大大降低雄激素受体的效用，其增强效用的降低，减弱了其对基因表达的调节。从我们的实验结果中表明突变的７０％都集中在外显子Ａ上说明少精或精子无活力不育患者主要原因很可能是ＡＲ基因外显子Ａ的突变，导致转录激活作用的减弱，从而产生ＡＩＳ。
为更进一步详细了解ＡＲ基因突变在少精不育发生中的作用需要用更大群体的标本和对突变点作核苷酸和氨基酸的序列分析，才可以全面的认识到ＡＲ基因的作用机制。 ４ 参考文献
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