血红素氧合酶-1及Toll样受体2/4在直肠癌组织中的表达及意义

作者：田飞    作者单位：山东大学附属省立医院

【摘要】  目的：探讨血红素氧合酶-1（hemeoxyenase-1，HO-1）和Toll样受体2/4（Toll-like receptor 2/4，TLR2/4）在直肠癌中的表达及意义。方法：应用免疫组织化学法和RT-PCR检测30例直肠癌组织中HO-1蛋白以及HO-1 mRNA、TLR2/4 mRNA的表达。结果：直肠癌组织中HO-1蛋白表达（13/30）明显高于正常组织（3/30）（P<0.05），HO-1 mRNA表达也明显高于正常组织（t =15.24, P <0.05）；直肠癌组织中TLR 2/4 mRNA的表达高于正常组织（P <0.05），且HO-1 mRNA与TLR2/4 mRNA表达之间存在相关性（P <0.05）。结论：HO-1和TLR2/4在直肠癌组织中高表达且呈正相关，提示参与直肠癌的发生、发展。

【关键词】  直肠肿瘤 血红素氧合酶-1 Toll样受体

     Expression and significance of heme oxygenase-1 and Toll-like receptor 2/4 in rectal carcinoma

    TIAN Fei1, ZHANG Li1, GUO Qiong-xing1, CUI Bin2, ZHANG Jin3, ZHANG Shu-qing1, DENG Jia4

    1Department of gastrointestinal surgery, 2Department of Central Laboratory, 3Department of Pathology, 4 Department of Dermatology, Affiliated Provincial Hospital, Shandong University （Jinan 250021, China）

    【ABSTRACT】 Objective: To investigate the expression and significance of hemeoxygenase-1（HO-1）and Toll-like receptor 2/4 （TLR2/4） in rectal carcinoma. Methods: The expression of HO-1 protein and HO-1 mRNA、TLR2/4 mRNA in 30 cases of rectal carcinoma was measured using immunohistochemical method and reverse transcriptase-polymerase chain reaction （RT-PCR）. Results: The expression of HO-1 protein in rectal carcinoma （13/30）was significantly higher than those in normal tissue（3/30）（P <0.05）.The expression of HO-1 mRNA was also significantly higher than those in normal tissue （t =15.24, P <0.05）;The expression of TLR2/4 mRNA in rectal carcinoma was higher than those in normal tissue（P <0.05）, and HO-1 mRNA expression was associated with TLR2/4 expression（P <0.05）. Conclusion: The expression of HO-1 and TLR2/4 was higher in rectal carcinoma and had association with each other.

    【KEY WORDS】 Rectal carcinoma·Hemeoxygenase-1·Toll-like receptors

    血红素氧合酶-1（hemeoxygenase-1, HO-1）又称热休克蛋白32（hot shock protein 32, HSP32），是将血液循环中衰老的红细胞及血红蛋白释放出的血红素降解为铁离子、胆绿素与CO的起始酶和关键酶。Toll样受体（Toll-like receptors，TLRs）与Toll蛋白同源，是目前发现并且研究较多的天然免疫因子，在参与促炎反应、促进免疫细胞成熟分化及调节免疫应答等方面发挥重要作用，TLR2/4是研究较多、功能认识较为全面的2种。最近的研究表明HO-1和TLR2/4可能参与多种恶性肿瘤的发生、发展及转移过程，并可作为相关免疫佐剂治疗肿瘤。本研究用免疫组织化学和RT-PCR技术，对直肠癌组织及正常组织中HO-1和TLR2/4表达水平进行测定，探讨HO-1和TLR2/4在直肠癌发生、发展中的作用，为进一步了解直肠癌的发病机制及探索其治疗新途径提供理论基础。

    1　资料与方法

    1.1　一般资料　连续收集山东大学附属省立医院胃肠外科2006年12月—2007年4月直肠癌根治术中切除的直肠癌标本30例，其中男18例，女12例。年龄51～82岁，平均年龄64岁。高位直肠癌13例，中低位17例。术后病理组织学检查确诊为直肠癌，直肠癌组织距肿瘤边缘<3 cm,切下后30 min内采集，立即存于液氮中,以距肿瘤中心10 cm的正常直肠黏膜组织为对照。

    1.2　方法

    1.2.1　免疫组织化学法检测HO-1蛋白的表达　鼠抗人HO-1单克隆抗体、即用型SABC免疫组织化学染色试剂盒及DAB显色试剂盒均购自武汉博士德公司。实验方法严格按照试剂盒操作说明进行。HO-1阳性细胞计数：HO-1阳性细胞表达为棕黄色颗粒，高倍镜下主要存在于细胞质中，细胞膜上也有少量表达。光镜下随机选取10个连续不重复的高倍（×400）视野，综合染色强度和阳性细胞百分数进行半定量评分。不着色为0分，浅棕黄色为1分，深棕黄色为2分；阳性细胞百分数≤1％为0分，<20%为1分，20％～50％为2分，>50％为3分。2项相加0～1判为-，2为+，3～4为++，＞4为+++。以-～+为阴性，++～+++为阳性。

    1.2.2　RT-PCR法检测HO-1 mRNA、TLR2/4 mRNA的表达　用Trizol法提取组织总RNA，Trizol购自上海生工生物公司（Sangon）。紫外分光光度计测定RNA纯度及浓度，每例标本取总RNA 5 μg。按试剂盒（Fermentas #k1622）操作说明合成第1链cDNA，最后以cDNA为模板进行PCR。HO-1正义序列：5-GCTTCACATAGCGCTGCA-3；反义序列：5-CAGGCAGAGAATGCTGAGTTC-3，产物长度269 bp；TLR2上游引物：5-GCCAAAGTCTTGATTGATTGG-3，下游引物：5-TTGAAGTTCTCCAGCTCCTG-3，产物长度345 bp；TLR4上游引物：5-TGGATACGTTTCCTTATAAG-3，下游引物：5-GAAATGGAGGCACCCCTTC-3，产物长度505 bp；β-肌动蛋白（β-actin）正义序列：5-GCTTACATGTCTCGATCCCACTTAA-3，反义序列：5-CTCGCGCTACTCTCTCTTTCTGG-3，产物长度333 bp。各引物均由上海生工（Sangon）合成，PCR试剂盒购自TaKaRa公司。PCR反应条件为： 94 ℃预变性5 min，94 ℃变性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，共扩增35个循环，最后72 ℃延伸10 min。

    PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳观察，并用Alpha Imager 2200凝胶成像系统进行扫描分析，结果以HO-1、TLR2/4产物与β-actin吸光度的比值表示相对表达强度。

    1.3　统计学处理　采用SAS 9.13 软件包进行统计分析，各指标以x±s表示，肿瘤与正常组织之间的计数资料采用t 检验，构成比差别采用χ2 检验，Pearson等级相关分析，P ≤0.05为差异有统计学意义。

    2　结果

    2.1　免疫组织化学结果　直肠癌组织及正常黏膜组织中都有HO-1表达，正常黏膜组织中表达量少10％（3/30），在直肠癌组织中表达明显增高43.3%（13/30，χ2 =8.522 7，P =0.003 5）。HO-1染色阳性主要位于肿瘤细胞的细胞质，细胞膜有少量表达。颜色越深、颗粒越密表示阳性信号越强（图1）。

    2.2　RT-PCR结果　HO-1 mRNA及TLR2/4 mRNA的表达情况见表1。

    2.2.1　琼脂糖凝胶电泳结果与DNA Marker的比较　　HO-1产物位于269 bp，TLR2产物位于345 bp，TLR4产物位于505 bp，β-actin产物位于333 bp，与引物设计时预计大小相一致（图2）。通过Alpha Imager 2200凝胶成像系统进行扫描分析及统计分析可以看出，直肠癌组织及正常组织中均有HO-1 mRNA和TLR2/4 mRNA表达，但在直肠癌组织中的表达水平均明显高于正常组织，差异有统计学意义（P＜0.05）。

    2.2.2　Pearson相关分析　结果显示HO-1 mRNA和TLR2/4 mRNA在直肠癌组织与正常黏膜组织中的表达有显著相关性（HO-1与TLR2之间r=0.827 2，P ＜0.05，HO-1与TLR4之间r＝0.913 3，P＜0.05）。

    3　讨论

    3.1　HO-1在直肠癌组织中的表达及意义　HO-1反应体系的三大代谢产物均有较强的生理作用，是HO-1发挥抗炎抗氧化、抗凋亡和抗增生功能的主要效应分子。HO-1涉及的信号及转导通路主要是丝裂原激活蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases, MAPK）途径。本研究结果显示，在直肠癌和正常黏膜组织中都有HO-1表达，但正常组织中表达较少，直肠癌组织中HO-1 mRNA和HO-1蛋白的表达要明显高于正常组织。

    HO-1在肿瘤组织中发挥作用的具体机制还不甚清楚，近年来受到广大临床及基础研究人员重视。目前多认为HO-1与肿瘤细胞的凋亡发生有关，肿瘤生长过程中释放的细胞因子也能激活HO-1系统。由于肿瘤细胞生长迅速，耗氧量增加，造成局部组织缺氧、氧化应激、新血管形成，可以激活HO-1表达增加，从而发挥细胞保护作用。Brouad等［1］认为HO-1的抗凋亡机制是通过HO-1的代谢产物CO或p38丝裂原激活蛋白激酶信号传导途径介导。Fang 等［2］用聚乙烯-乙二酯-糖结合锌原卟啉 [poly （ethylene glycol）- conjugated ZnPP, PEG-ZnPP]在体内试验有阻止HO-1活性及抗肿瘤作用,并经药代动力学检测发现血液中ZnPP的维持时间比单用ZnPP长40倍;体外试验结果发现PEG-ZnPP诱发了氧化应激并导致SW 480人结肠癌细胞凋亡。也有报道发现HO-1在前列腺、胰腺等实体肿瘤组织中表达升高［3］。国内也有相关研究显示，HO-1在人类乳腺癌组织中的表达要明显高于正常乳腺组织［4］，且高于乳腺增生、乳腺纤维腺瘤［5］。

    3.2　TLR2/4在直肠癌组织中的表达及意义　TLR是细胞表面一类受体，参与许多疾病的发病过程，与传染病、肿瘤、心血管病、自身免疫性疾病、过敏反应等都有着密切关系。TLR家族中最重要的成员是TLR2/4，其信号传导通路分为髓样分化因子88（myeloid differentiation factor 88, MyD88）依赖性和非依赖性两种，以前者为主。由于TLR2/4细胞内段与IL-1受体相似，可与MyD88结合，引起自磷酸化，最终通过多种途径激活NF-κB,导致多种炎症因子的瀑链式释放而产生生物学效应，导致一系列炎症因子分泌和功能变化。

    本研究结果显示在直肠癌组织中TLR2/4表达增高，提示可能是通过信号转导通路诱导细胞因子产生，从而使癌细胞逃避免疫监视，促进肿瘤细胞生长。国内有研究表明用卡介苗治疗膀胱癌的作用机制可能是BCG通过上调膀胱癌细胞TLRs的表达而介导IL-12表达升高，使局部免疫应答向细胞免疫发展，以利于产生抗肿瘤反应［６］。Okamoto等［７］发现链球菌制剂oK-432和一种从植物中提取的相对分子质量为55×103的蛋白能诱导Thl细胞反应并发挥强抗癌效应，而TLR4信号途径密切参与这两种免疫增强剂诱导的抗肿瘤免疫。因此，运用TLRs信号通路在临床应用于癌症的治疗是有很大希望的。

    3.3　HO-1与TLR2/4在直肠癌组织中表达的相关性　本研究通过分析证实HO-1和TLR2/4在直肠癌组织中高表达存在相关性，提示二者在直肠癌的发生机制中存在着一定的关联。已有的研究发现，TLR4是脂多糖（1ipopolysaccharide，LPS）诱导细胞产生HO-1的主要受体，两者都是通过MAPK信号传导途径，导致多种炎症因子的释放而产生一系列生物反应。LPS先与血清的LPS结合蛋白（LPS-binding protein，LBP）结合，然后再结合于细胞表面的CD14分子。LPS／LBP／CD14复合物通过与TLR4胞外区的MD-2分子结合，激活TLR4的表达。TLR4可与MyD88结合，引起自磷酸化，通过多种途径激活NF-κB。而HO-1诸多信号传导途径中主要的途径就是MAPK途径，诱导HO-1基因表达的众多刺激同样也会影响MAPK的活性。本研究也证明HO-1和TLR2/4在信号传导途径上相互关联，具体的分子生物学机制还有待于进一步研究。

【参考文献】[1] Brouard S, Otterbein LE, Anrather J, et a1. Carbon monoxide generated by heme oxygenase l suppresses endothelial cell apoptosis[J]. J Exp Med, 2000,192（7）:1015-l026.

[2] Fang J, Sawa T, Akaike T, et al. In vivo antitumor activity of pegylated zinc protoporphyrin: targeted inhibition of heme oxygenase in solid tumor[J]. Cancer Res, 2003,63（13）:3567-3574.

[3] Makoto Sunamura, Dan G. Duda, Aivel H. Ghattas, et al. Heme oxygenase-1 accelerates tumor angiogenesis of human pancreatic cancer[J]. Angiogenesis, 2003,6（1）:15-24.

[4] 叶颖江，王杉，严飞飞，等.经p38α通路激活的HO-1在乳腺癌发生和耐药中的作用[J].中华普通外科杂志，2006，21（3）:215-217.

[5] 刘胜春，吴凯南.HO-1在良、恶性乳腺组织中的表达及意义[J] .重庆医科大学学报，2006，31（4）:561-565.

[6] 李响，龚志勇，李虹，等.卡介苗诱导膀胱癌T24细胞表达钟声蛋白样受体和产生细胞因子的研究[J]．中华外科杂志，2004，42（3）：177-181.

[7] Okamoto M，Sato M．Toll-like receptor signaling in anti-cancer immunity[J]． J Med Invest, 2003,50（1-2）：9-24.