糖尿病大鼠血栓调节蛋白与颈动脉病变的关系

作者：糖尿病大鼠血栓调节蛋白与颈动脉病变的关系    作者单位：江苏省常州市第三人民医院内分泌科， 常州 213001

【摘要】  目的：探讨血栓调节蛋白在糖尿病大鼠颈动脉病变中的作用。方法：Wistar大鼠48只随机分为A组24只和B组24只，B组注射链脲佐菌素制造糖尿病模型。成模后6、10和14周每组处死8只，测定颈动脉内中膜厚度、血糖、体重、血栓调节蛋白、空腹胰岛素、C肽及血脂水平。结果：随病程延长，B组空腹血糖、血栓调节蛋白、总胆固醇、甘油三酯及低密度脂蛋白显著高于A组，胰岛素、C肽及高密度脂蛋白显著低于A组；B组右颈动脉内中膜厚度在10，14周时较A组厚度明显增加；B组颈动脉内中膜厚度与血栓调节蛋白呈显著正相关。结论：糖尿病大鼠血栓调节蛋白升高与颈动脉病变显著相关，血栓调节蛋白升高先于颈动脉病理改变的发生，可能成为糖尿病颈动脉病变发生的重要早期预测指标。

【关键词】  糖尿病；血栓调节蛋白；颈动脉病变；大鼠

Study on the relationship between TM and carotid artery lesion in diabetic rats

    ZHANG Fan, DAI Qing, HE Jun      (The Third People’s Hospital of Changzhou， Changzhou 213001)

    [Abstract]   Objective: To explore the role and relationship of thrombomodulin（TM） in the development of carotid artery lesion in DM and  provide the foundation in early stage of carotid artery lesion occurred in DM. Methods: 48 Wistar rats were randomly divided into two groups. There were 24 in both groups respectively. The subjects in group B were injected with streptozotocin (50 mg/kg). After six, ten and fourteen weeks, their blood samples were obtained to measure the levels of TM，FINS，C-peptide，TG, TC, HDL and LDL, and the carotid artery intima-media thickness (IMT) was also measured.  These data were compared between two groups. Results: There were differences in the levels of FINS , C-peptide, TG, TC, HDL and LDL between group A and group B .The level of TM in group B was much higher than that in group A. The IMT of group B was higher than that of group A. Conclusion:  The increase of TM occurred before visible and measurable carotid artery pathological changes. TM could be used as an early index to predict DM carotid artery lesion.

    [Key words]   Diabetes；Thrombomodulin；Carotid artery lesion；Rat

    糖尿病心脑血管疾病发病率高，发生早、病情重，因此早期诊断、治疗十分重要。近年研究表明[1]，作为血栓前状态分子标志物的血栓调节蛋白在大血管发生动脉粥样硬化的早期就有所增加，可能在加速糖尿病大血管病变方面起着潜在作用，因此日益引起关注。本研究通过测定各阶段糖尿病大鼠血浆中血栓调节蛋白变化及颈动脉的病理变化，探讨在糖尿病动脉粥样硬化发生、发展的各阶段血栓调节蛋白所起的重要作用，为防治糖尿病动脉粥样硬化发生、发展寻找一条新的途径。

    1   材料与方法

    1.1   材料   （1）实验动物：选用近交、清洁级Wistar 大鼠48只（山西医科大学动物中心提供），12周龄，雄性，体重220~250 g；（2）药物及试剂：链脲佐菌素（STZ）购自美国Sigma公司；血糖采用罗氏公司ACCU-CHEK优越血糖仪测定；血栓调节蛋白、空腹胰岛素、C肽、血脂用酶联免疫方法测定（Rat）试剂盒购于大连泛邦生物制剂公司，批内差异﹤10%；颈动脉内中膜厚度的测定。

    1.2   实验方法

    1.2.1   分组及剂量   随机分为正常对照组24只（A组），实验组24只 （B组），两组再分为6周、10周和14周组，共计6组。均自由进食进水，12 h光照周期。A组腹腔注射50 mg/kg体重的枸橼酸缓冲液以pH4.2的0.1 mmol/L作对照。B 组腹腔一次性注射STZ 50 mg/kg体重 （以pH4.2的0.1 mmol/L枸橼酸缓冲液配成0.1%浓度）。72 h测空腹血糖>16.7 mmol/L为造模成功。

    1.2.2   标本的采集和处理   造模成功后6、10、14周时两组各取8只大鼠称重、剪尾测空腹血糖，腹腔麻醉，分离右颈动脉，心内采血6 ml分别置于于含有枸橼酸钠抗凝剂的试管和普通试管中各3 ml，离心2500 r/m×15 min，用所分离的血浆测定血栓调节蛋白，血清测定空腹胰岛素、C肽及血脂。

    1.2.3   光镜、电镜观察   取下右颈动脉，置入10%甲醛液，常规梯度乙醇脱水，石蜡包埋，制备载玻片，光镜下观察病理变化。在同上位置连续切下2～3个1 mm宽环，2%戊二醛固定2 h，二甲胂酸钠缓冲液内放置若干天后，1%锇酸固定2 h，丙酮梯度脱水，618环氧树脂包埋，超薄切片，铅铀染色，透射电镜（JEM-100EX Japan）下观察。

    1.2.4   颈动脉内中膜厚度的测定   使用四川大学智胜软件股份有限公司Mias-2000真彩色病理显微图像分析系统进行分析。每例标本的病理切片上随机选取5个不同位置，对颈动脉内中膜厚度进行测定，取其均值作为每例标本内中膜的厚度。

    1.3   统计学方法   所有数据采用SPSS12.0统计软件处理，结果以■±s表示，影响因素的比较采用两因素析因设计的方差分析，组间比较采用t检验和方差分析，两变量间的相关关系用Pearson直线相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。

    2.1.1   由表1、2可见B组大鼠体重在6周时与A组无明显差别，10、14周时较A组有显著降低（分别为P<0.05，P<0.01）。B组空腹血糖均值达26.72 ±4.02 mmol/L较A组差异有统计学意义（P<0.01），达到糖尿病诊断标准，而A组大鼠空腹血糖变化不明显。空腹胰岛素（INS）及C肽、总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）在第6、10、14周时较A组均有显著差异（P<0.01），高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）在6周时两组间差异无统计学意义。在10周时分别有降低、增高的趋势，但差异无统计学意义；在14周时HDL、LDL分别明显低于、高于A组（P<0.05）。

    2.1.2   由表3可见B组大鼠血栓调节蛋白在第6、10、14周时始终保持上升趋势，与A组比较差异均有统计学意义（P<0.05，P<0.01）；右颈动脉内中膜厚度在6周时较A组增加但不显著，在10、14周时较A组厚度明显增加（P<0.01）。

    2.1.3   由表3两因素线性相关分析结果表明，B组颈动脉内中膜厚度与血栓调节蛋白呈显著正相关（r=0.876，P<0.01），而A组大鼠颈动脉内中膜厚度与血栓调节蛋白无相关性。

    2.2   组织病理学特征比较

    2.2.1   光镜下组织病理学特征   与A组颈动脉内皮细胞和中膜平滑肌细胞排列规则相比（图1），B组大鼠在6周时颈动脉内膜内皮细胞规则，中膜轻度平滑肌增生（图2）；随病程延长，10周、14周时内皮细胞排列逐渐紊乱，中膜平滑肌细胞明显增生，导致颈动脉管壁显著增厚（图3、4）。

    2.2.2   电镜下组织病理学特征   14周时B组大鼠可见颈动脉内皮细胞广泛坏死、溶解、核碎裂，变性坏死的细胞与基底膜脱离或脱落，内弹力膜被溶解破坏出现断裂，局部呈双轨状，部分个体可见中膜平滑肌细胞穿越内弹力膜进入内膜层（图5）与A组平整的内皮细胞有显著差异（图6）。  

    3   讨      论

    糖尿病和心脑血管病变之间的关系极为复杂，心脑血管疾病的病因大多与动脉粥样硬化有关。颈动脉粥样硬化是其大血管并发症之一，且先于冠心病及脑梗死而发生[2-4]。本实验首先成功制备了糖尿病大鼠模型。Arison等1967年指出链脲佐菌素首先损伤β细胞及有关细胞器的膜结构， 将DNA 碱基上的特殊位点烷基化之后， 再进一步作用于ADP 核糖体合成酶，引起酶扩散和酶活性的改变， 进而影响β细胞功能和结构改变。

    血栓调节蛋白是由内皮细胞表达于细胞膜外的一种凝血酶结合蛋白，由中性粒细胞、单核细胞、血小板、间皮细胞等合成释放。广泛分布于人体内动脉、静脉、毛细血管、淋巴管内皮细胞腔面[5]。血栓调节蛋白有膜型、可溶性两种形式，血栓调节蛋白与凝血酶有高亲和力，主要作用有：抗凝活性，抑制血小板黏附和聚集，抑制纤溶发生，促使蛋白C（PC）快速活化[6]。血栓调节蛋白作为凝血系统的成员参与凝血和炎症反应的调控，对糖尿病动脉粥样硬化起到了重要作用。

    颈动脉病变是慢性炎症性疾病，内皮细胞、巨噬细胞、血管平滑肌细胞是构成动脉病变的三个要素，内皮细胞损伤是始动环节。糖尿病损伤血管内皮的机制为[7]：高血糖直接抑制血管内皮细胞DNA合成，影响内皮细胞更新；慢性高血糖状态下内皮细胞膜功能蛋白的非酶糖基化使细胞膜受损；高血压造成内皮机械损伤；高糖至局部血流淤滞，组织缺氧自由基损伤内皮。此外山梨醇代谢亢进、血管舒缩因子的不平衡、内皮细胞表面黏附因子增加等因素协同作用导致了糖尿病内皮损伤[8]。

    Sharma等[9]认为血栓调节蛋白升高与内皮损伤呈正相关，在糖尿病无血管病变发生时血栓调节蛋白已显著升高，并发血管病变时升高更明显。动脉硬化病变广泛患者血栓调节蛋白水平较单一动脉硬化病变者升高明显，血栓调节蛋白与颈动脉粥样硬化易发现象呈正相关，这一结论也在本实验中得到了证实。Aird等[10]提出，当糖尿病患者内皮受损时，血栓调节蛋白由内皮细胞表面脱落入血，凝血途径激活，导致血栓调节蛋白作为凝血标志物增加，高凝状态下，血流变缓，血液黏稠，动脉粥样硬化的发生率明显增高。动脉粥样硬化最早的病理改变是内膜增厚，我们在本组实验中通过光镜、电镜及图像分析发现，B组大鼠在实验的第10、14周，颈动脉内皮出现明显的病理改变，颈动脉内中膜厚度明显增厚，而A组变化不显著，说明糖尿病具有引起动脉粥样硬化的作用。B组血栓调节蛋白水平的升高在颈动脉出现明显病理改变前，即第6周已有明显增加。直线相关分析结果表明，B组颈动脉内中膜厚度与血栓调节蛋白表达呈正相关，随着血浆血栓调节蛋白水平的上升，颈动脉内中膜厚度增加显著。

    上述结果提示，血栓调节蛋白表达增强可能参与了动脉粥样硬化的形成过程，可能是导致糖尿病动脉粥样硬化的原因之一，而不仅是动脉粥样硬化的结果[11-12]。由此证明，血栓调节蛋白升高在出现糖尿病心脑血管病变前已存在，并随糖尿病病情加重、血管并发症的出现而浓度升高。血栓调节蛋白升高与内皮损伤呈正相关[13]，作为内皮细胞受损的指标之一，具有浓度相对稳定、不随年龄增长变化、不受轻度刺激影响、反映内皮细胞损害的敏感性及可靠性较强的特点，因此血栓调节蛋白被认为是反映血管内皮细胞损伤及损伤程度的金标准。动态监测血栓调节蛋白水平可作为糖尿病动脉粥样硬化的早期预测指标，对尽早发现糖尿病动脉粥样硬化，采取相应预防、治疗措施，延缓糖尿病动脉粥样硬化，减少心脑血管事件的发生发展有重要意义。

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