脓毒症大鼠肝脏缺氧诱导因子-1α的表达及其与肝脏损伤的关系

脓毒症是临床创伤、烧伤和感染性疾病患者的常见并发症,可造成多器官功能障碍,表现在肝脏、肾脏等对缺氧敏感器官中损伤表现的非常显著。脓毒症,尤其是重度脓毒症和感染性休克一直是危重病医学研究的重点和难点,病死率高达⒛%~ sO%[1]。缺氧诱导因子-1α (ⅢF-1α )是调控哺乳动物缺氧适应性反应的一类关键转录因子,调控几乎糖酵解过程中的所有酶的转录因子。乳酸是糖酵解产物,由丙酮酸还原而来,正常情况下,肝脏有强大的利用乳酸的能力,将乳酸氧化为丙酮酸,再经过肝脏合成肝糖原从而被利用。脓毒症中肝脏缺氧而功能降低,处理乳酸能力下降,导致乳酸堆积,代谢障碍,同时导致反应肝脏损伤的直接指标转氨酶水平升高。鉴于HIF-1α 在缺氧调控中起着重要作用,本实验采用大鼠盲肠结扎穿孔术(CLP)所致脓毒症模型,观察脓毒症模型大鼠在不同时期的肝脏细胞 HIF-Iα 的蛋白表达水平、相应时间点血清乳酸、血清谷草转氨酶(ALT)及谷丙转氨酶(AST)水平,进而探讨ⅢF-1α 在脓毒症中的意义,分析HIF-1α 与血清乳酸水平、肝脏转氨酶水平及肝脏病理损伤程度间的联系。

1 材料与方法

1.1 严重感染动物模型的建立 清洁Spragle- Da1。/ley大鼠共I50只(中国医科大学动物中心提供),体质量为(235.6± 11,2)g,饲养1周,实验动物模型制备(即大鼠CLP)参考RiⅡirsch等[2]方法, 实验前禁食过夜,自由饮水。以10%水合氯醛0.3 mI/1OO kg腹腔麻醉,常规消毒腹部,皮肤正中切口 (长约2cm),打开腹腔后小心分离盲肠,避免损伤肠系膜血管。寻找盲肠与小肠和大肠交界处,用0 号丝线环形结扎盲肠。在与肠系膜相对的盲端肠壁浆膜面用9号针贯通穿刺2次,并留置1条长1cm、宽2mm、两头贯穿盲肠的橡皮片,防止针孔闭合,原位还纳肠管至腹腔,消毒切口并逐层缝合腹壁。

1.2 实验动物分组 将实验大鼠随机分为三组:正常组sO只,假手术组sO只,CLP手术组sO只,各组体质量均值比较差异无统计学意义。假手术组仅游离盲肠,不做盲肠结扎穿孔。CI~P手术组于手术成功后的第6、12、z、缌、” 小时分别处死10只大鼠, 并于每时相点用10只健康大鼠和10只假手术组大鼠作为对照。为了保证实验的完整性,另取gO只大鼠进行CP手术以补充在造CLP模型中各时间点死亡大鼠,使CLP组大鼠每时间点大鼠数达到10 只;取⒛ 只大鼠行假手术,补充假手术组各时间点死亡大鼠。

1.3 实验药品和试剂 兔源抗大鼠HIF-1α 多克隆一抗(德国Saint Cmz,∞ -10790),β -Actin(德国⒊i"Cmz,∞ -1⒍ 6),辣根酶标记山羊抗兔二抗 (美国Jackson,1I1-∞ 5-O03),ECL显色剂(德国 Saint Cmz,sc-2048),蛋白酶抑制剂混合物(美国 ⒊gma,Pg弼0),细胞裂解液(美国⒊gma,C32⒛ ),预染蛋白Marker(⒐ nvi泖,B023),PVs001凡002聚合酶二步法即用型试剂盒(美国Power Ⅵ⒍c,nTM公司), 浓缩型DAB试剂盒(北京中杉公司,ZLI-9O31/ 9032/9033)。

1.4 组织取材 在各时间点予戊巴比妥sO mg/kg 麻醉后处死大鼠,迅速取出肝脏,取一块体积约 1cm× 1cm× 1cm的组织块用于制各石蜡切片,石蜡切片用于经HE染色后在显微镜下进行病理学分析及免疫组化,其余组织-gO℃ 冻存各用,用于进行Westem blot分析,测定ⅢF-1α 水平。

1.5 肝脏中HIF-1α 蛋白表达的测定

1.5.1 We哎em blot法定量检测 取-gO℃ 冻存的各组大鼠肝组织各100mg,加入2~3mL的组织蛋白裂解液,匀浆器将组织研碎,取出匀浆液4℃ 离心,165OO r/血n,15而n。取上清液,按Low叩法测量蛋白浓度。等量蛋白上样进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,用PⅤDF膜转膜(半干转法)。经封闭、标1抗(1:200)、标2抗(1:2000)、ECL法显色。每一脏器分别取三份独立样本,测定HIF-1α 蛋白水平表达,并在同样情况下测定内参β-actin,将均一条件下两者的光密度比值作统计。Westem blot法蛋白定量图像分析,采用UⅤI son UⅤIB and Applicatic,nⅤ 叨.∝ 图像分析系统。

1.5.2 免疫组织化学法定位检测 取相应组的肝组织石蜡切片,经乙醇脱蜡,放入枸橼酸盐缓冲液中煮沸修复抗原,PBS洗涤降温,滴加1%小牛血清封闭10m血,PBS洗脱甩干,滴加HIF-1α 一抗,37℃ 湿盒中孵育120而n,PBS洗脱甩干,PⅤ 试剂盒(二抗:山羊抗兔坨G抗体-HRP多聚体)50uL/样本, ~sT℃ 湿盒中孵育⒛ ~3O min;PBS洗脱甩干,DAB 显色时间6~8min,苏木素复染;脱水透明封片。

1.6 采用化学发光法测定血清乳酸、ALT及AST 乳酸测定试剂盒购自沈阳博洋生物试剂有限公司, ALT和AST测定试剂盒购自沈阳博洋生物试剂有限公司,所有实验样本均在同一天相同条件下测得。

1.7 统计学处理 本实验计量资料应用均数±标准差(死±s)表示。采用J检验和Pearson相关分析等方法进行数据分析,以P<0.Os为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 不同时间点大鼠死亡率 在大鼠行盲肠结扎术所致脓毒症模型后10只里6h仅1只大鼠死亡 (死亡率10%),⒓ h有3只大鼠死亡(死亡率 30%),zh有5只大鼠死亡(死亡率50%),48h大鼠死亡7只(死亡率⒛%),” h大鼠死亡8只(死亡率SO%);假手术组大鼠仅在12h和zh各死亡 1只(死亡率10%),在” h死亡3只(死亡率 30%),远远低于CP组;而正常组大鼠在各个时间点都没有大鼠死亡。为了保证实验的完整性,另取 gO只大鼠进行CLP手术以补充在造CLP模型中各时间点死亡大鼠,使CLP组大鼠各时间点总数保持 10只;取⒛ 只大鼠行假手术,补充假手术组各时间点死亡大鼠。

2.2 CLP模型大鼠肝脏的病理学改变 对各时间段的大鼠进行解剖后发现,CLP术后6h组盲肠水肿,周围组织有炎性渗出。12h和猬h组动物腹腔炎症明显,腹腔有脓性或血性渗出液,恶臭;盲肠肿胀,与周围组织甚至腹壁粘连广泛,分离困难,肠管胀气明显;肝脏淤血水肿。48h及” h尚存活动物,可见结扎穿孔处明显被周围组织包裹,腹腔炎症有所减轻。在们倍光镜下,可见正常组(见彩色插页图1A)及假手术组(见彩色插页图1B)动物肝脏小叶结构完整,肝细胞形态及胞核清晰可见;CLP组动物在CI~P术后6h肝脏小叶结构完整,形态大致正常,可见细胞水肿(见彩色插页图1C);CLP后 12h、zh和48h小叶结构基本完整,肝细胞胂胀, 胞质疏松化,可见空泡样变性、脂肪变性,脂肪变性的范围从小叶同边逐渐向中心扩散,最后呈弥漫性分布,符合缺氧性改变并可见散在的肝细胞坏死,核固缩和核碎裂,肝窦扩张淤血,偶见白细胞浸润(见彩色插页图ID~F);肝脏的病理损伤在CLP后 48h最重,CLP后” h的肝小叶结构基本完整,与 ⒓ h、以h及48h组比较,肝细胞肿胀减退,炎症有所减轻,但仍较对照组严重。每组取3只大鼠的脏器进行HE染色进行对比后发现,肝脏的病理损伤在CLP后48h组最重(见彩色插页图1G)。

2.3 不同时间点肝脏组织HIF-1α 水平表达 CLP6h、⒓ h和以h组肝脏HIF-1α 水平的表达较正常组和假手术组表达均增高,且有显著性改变 (P<0.05),而CLP鲳h组肝脏HIF-1α 基本恢复正常,较正常组和假手术组差异无统计学意义(P> 0.05)。αP组内:CLP后6h、1zh和⒛ h之间比较差异无统计学意义(P>0。Os),但三者较CLP48 h组相比表达增高,且差异有统计学意义(P( 0.05)。因而,在不同时间点,肝脏HIF-1α 水平的表达呈趋势性改变:CLP组6h内即已发生肝脏表达HIF-1α 水平的变化,于CLP6h时即达高峰,并持续至zh时,在z~48h时间段肝脏HIF-1α 水平开始下降,并且在48h已基本回落正常(见图 2A、2B)。免疫组化法定位HIF-1α 结果显示,正常组及CLP手术后各组均可见HIF-1α 水平表达, 胞核可见呈棕黄色染色,散在分布,且均以胞核染色为主。

2.4 不同时间点血清乳酸、ALT及AsT水平的测定

2,4.1 血清乳酸结果 CLP组12h与γ h乳酸水平明显升高,与正常组及假手术组相同时间点比较, 差异有统计学意义(P<0.∞ );其他CLP组时间点乳酸水平与正常组和假手术组相同时间点进行比较,差异无统计学意义(P)0。Os)。 2.4.2 血清ALT、AsT测定 ALT,K平:CLP组12 h与zZI h ALT水平明显升高,与正常组和假手术组相同时间点比较,差异有统计学意义(P(0.Os), CLP组各时间点ALT水平与正常组和假手术组相同时间点进行比较,差异无统计学意义(P>0.0~s); AST水平:CLP组每个时间点AsT水平均明显升高,与正常组及假手术组比较,差异均有统计学意义 (P<0,05)。见表1。 2.5 HIF-1α 水平表达与血清乳酸水平及血清 ALT、AST相关性分析 ⅢF-1α 水平与乳酸水平存在正相关Jl± (r=0。“1,P<0.Os);Ⅲ F-1α 水平与血清ALT水平二者间存在正相关性(r=o.绍6, P(0。“);HIF⋯ 1α 水平与血清A叩水平二者间未能证实存在相关性(r=o.122,P)0。Os)。

3 讨论肝脏作为脓毒症常累及的重要器官之一,在机体代谢及防御方面起着重要的作用[3]。肝脏作为清除乳酸的主要器官之一[4],其损伤可直接导致体内乳酸水平变化[5]。乳酸是糖酵解产物,由丙酮酸还原雨来,正常情况下,肝脏有强大的利用乳酸的能力,将乳酸氧化为丙酮酸,再经过肝脏合成肝糖原从而被利用。在脓毒症时,组织血液灌流不足及缺氧,机体所需要的大多数能量只能从无氧酵解获得。而无氧酵解所产生的能量远比有氧代谢少,因而,导致糖原分解。无氧酵解可致乳酸堆积,发生高乳酸血症,同时肝功能减退、损伤,丙酮酸利用受阻导致血孚L酸水平升高致乳酸血症。从实验结果可以看出,脓毒症大鼠乳酸水平与肝脏病理损伤程度时间上基本一致,体现了乳酸对于脓毒症大鼠肝脏损伤程度的指向性。此外,作为直接反映大鼠肝脏损伤的转氨酶水平,与大鼠乳酸升高及肝脏病理损伤发生时间也基本一致,这也直接反映出大鼠肝脏损伤的程度及其与乳酸水平及病理变化的相关程度。

HIF-1α 是调控几乎糖酵解过程中的所有酶的转录因子,HIF-1α 蛋白作为一种转录因子,启动包括糖酵解在内的一系列的激活途径,对氧浓度变化敏感,通过HIF-1α 核转位,并与HIF-1β 形成异二聚体,其他共同作用的转录因子的募集以及与 HRE的结合,启动糖酵解途径及ⅤEGF等一系列机体适应性改变,同时增加ⅤEGF等因子的转录,促进血管内皮细胞增殖及血管生长,以增加血供,促使机体产生一系列适应性改变[7]。在脓毒症时,机体由于缺氧,ⅢF-1α 稳定性增加,过度表达,以起到代偿作用。本实验中,脓毒症大鼠HIF-1α 表达增高,体现出其对于大鼠肝脏损伤的提示意义及在脓毒症状态下对于肝脏损伤、糖酵解及乳酸水平的整个调控作用。