反相高效液相色谱法测定黄连生药中盐酸小檗碱的含量

作者                                        作者单位

徐颖                       第三军医大学新桥医院国家药品临床研究基地,重庆400037

周世文                     第三军医大学新桥医院国家药品临床研究基地,重庆400037

汤建林                     第三军医大学新桥医院国家药品临床研究基地,重庆400037

陈莎                       第三军医大学医学检验系临床生物化学教研室,重庆400038

药典中黄连原植物来源有3种:毛莨科植物黄(Coptis chinensisFranch)、三角叶黄连(CoptisdletoideaC.Y.Cheng etHsiao.)和云连(Coptis teeta Wall)分别被称为“味连”、“雅连”、“云连”。石柱黄连为毛莨科黄连,多年生草本植物,含有多种生物碱,其中含量最高的为盐酸小檗碱,又名黄连素,其含量可达5% ~8%,属异喹啉生物碱,具有抗菌、抗病毒、抗心律失常、保护缺血心肌、降血压、降血糖、抗胃溃疡、抗肿瘤及抗HIV等药理作用,临床上广泛应用[1]。

黄连总碱中盐酸小檗碱水溶性较好,含量较高,但在制剂的制备过程中容易被破坏。因此,测定其含量对控制黄连的质量具有重要意义。中国药典2000年版采用薄层扫描法测定制剂中的盐酸小檗碱的含量,方法较复杂,操作不方便。本研究采用改良的反相高效液相色谱法测定盐酸小檗碱的含量[2],方法简便、快速、灵敏性、准确性和重复性好[3, 4]。

1　材料与方法

1. 1　仪器

美国Beckman公司高效液相色谱仪,包括System Gold 126多溶剂输送泵, System Gold 166紫外检测器, 32 karat色谱工作站:日本岛津紫外分光光度仪(UV-2450)

1. 2　试剂

药材:石柱黄连(Coptis chinensisFranch,经张诗平副主任药师鉴定);对照品:盐酸小檗碱(中国药品生物制品检定所提供,批号: 0713-200107);试剂:乙腈为色谱纯,其余试剂为分析纯;所有试剂进柱前均过0. 22μm滤膜。

1. 3　色谱条件

流动相:乙腈∶水=42∶58 (含磷酸二氢钾25 mmol/L,十二烷基磺酸钠6. 2 mmol/L),色谱柱:Hypesi.l ODS2(5μm,4. 6 mm×150), S/N≥3;柱温:室温;检测波长: 350 nm;流速:1. 0 ml/min;进样量20μl。

1. 4　对照品溶液的制备

精密称取盐酸小檗碱对照品10. 08 mg,加甲醇溶解,定容于10 ml容量瓶中,使成1. 008 mg/ml的储备液存放于-4℃

冰箱,备用。

1. 5　供试品溶液的制备

将干燥后的黄连研磨成细粉,称取131. 80 g,用乙醇回流提取黄连小檗碱, 80%乙醇回流提取3次,第1次加6倍量乙

醇,提取2 h,第2次加5倍量乙醇,提取1. 5 h,第3次加4倍量乙醇,提取1. 5 h,得34·22 g浸膏,每克浸膏含3. 8 g生药,精密称取黄连浸膏1. 001 02 g,用甲醇溶解,定容于50 ml容量瓶,吸取1 ml于10 ml容量瓶中定容至刻度,再吸取1 ml于10 ml容量瓶中定容至刻度,使成0. 200 204 mg/ml的供试品溶液。

1. 6　线性关系考察

分别精密吸取储备液转移到10 ml容量瓶中,用甲醇定容至刻度,使成201. 6、100. 8、50. 4、25. 2、10.08μg/ml的对照品溶液。按照“色谱条件”项下操作,精密吸取上述配好的各浓度的对照品溶液各20μ,l由低浓度到高浓度进样,记录峰面积,以盐酸小檗碱峰面积积分值对盐酸小檗碱进样量进行线性回归。

1. 7　精密度试验

称取干燥盐酸小檗碱对照品7. 34 mg置于小烧杯中,用甲醇溶解并转移到10 ml容量瓶中,加甲醇定容至刻度,精密吸取该液1 m,l转移到10 ml容量瓶中,加甲醇至刻度,即得盐酸小檗碱对照品溶液(73·4μg/ml),照上述色谱条件操作,精密吸取该液20μ,l重复进样测定5次,考察本方法精密度。

1. 8　稳定性试验

精密吸取20μl同一供试品溶液,在上述相同色谱条件下,分别于0、0. 5、1. 5、3、8、24、32、48 h重复进样,量取峰面积,测定供试品稳定性。

1. 9　加样回收试验

精密量取已知盐酸小檗碱含量的同一批供试品5份,各2. 0 ml置10 ml量瓶中,各精密加入每毫升含盐酸小檗碱对照品10μg的甲醇溶液5m,l震摇,混合后加甲醇至刻度,摇匀,滤过,取续滤液20μ,l在上述相同色谱条件下分别进样,量取峰面积测定,并计算回收率。

1. 10　供试品含量测定

精密吸取三批供试品溶液各20μ,l照上述色谱条件,进样,记录峰面积,测定并计算供试品的含量。

2　结果

2. 1　色谱行为

在选定的色谱条件下,供试品紫外扫描在350 nm处有最大吸收峰(图1),对照品和供试品的HPLC谱图分别见图2。

图1　供试品紫外扫描在350 nm处有最大吸收A:对照组;B:供试品

图2　盐酸小檗碱HPLC色谱

2. 2　线性范围

测得盐酸小檗碱线性范围为10. 08~201. 6μg/m,l直线回归方程为Y=1 222 294. 2+74 782. 46X,r=0·999 9。

2. 3　精密度

同一对照品溶液重复进样5次,结果平均峰面积为5 925 363, RSD为1. 57%。

2. 4　稳定性

同一供试品溶液在0~48 h 8个不同时相点进样,结果平均峰面积为7 311 088,RSD为1. 07%。

2. 5　回收率

结果见表1。取供试品适量使其中含盐酸小檗碱8. 072μg/m,l加入盐酸小檗碱对照品溶液(5. 04μg/ml), 1 m,l共5份,照上述样品测定法测定,X=99. 36, RSD=1. 89%。表1　盐酸小檗碱回收率试验结果序号样品含量(μg/ml)

加入量(μg/ml)

测得量(μg/ml)

回收率(% )

平均回收率(% )

RSD(% )

1 8.072 5.04 13.05 98.7

2 8.072 5.04 13.13 100.4

3 8.072 5.04 12.93 96.4 99.36 1.89

4 8.072 5.04 13.01 100.1

5 8.072 5.04 13.17 101.2

2. 6　供试品的含量

精密吸取3批供试品溶液各20μ,l照上述色谱条件,分别进样,测得黄连浸膏中含盐酸小檗碱(16. 42±1. 6)%,生药中含盐酸小檗碱(4. 37±0. 4)%,RSD为9. 2%。

3　讨论

采用高效液相色谱法测定制剂中盐酸小檗碱含量已有文献报道,但由于制剂组成成分不同,所用流动相与制剂中检测波长也不完全相同。本试验曾试用多种比例溶剂系统对黄连药材中小檗碱含量的测定,最后确定以乙腈∶水=42∶58为流动相,检测波长为350 nm。本研究从分离度及峰形对流动相系统进行评价,并对选定的色谱条件进行了优化,改良了用HPLC测定黄连药材中盐酸小檗碱的方法。此方法分离效果好,简便快速,定量准确,灵敏度高,重现性好,可作为

黄连产品的质量控制方法。

关键词:黄连;盐酸小檗碱;高效液相色谱法

中图法分类号:R284　　　文献标识码:B

参考文献:

[1]王春明,许丽杰,黄庆柏. HPLC法测定静灵口服液中盐酸小檗碱的含量[J].药物分析杂志, 1995, 15(4): 38-39.

[2]潘　扬,王天山,郭立玮,等. HPLC法测定糖渴清片中小檗碱、掌叶防己碱和药根碱的含量[ J].南京中医药大学学报,1996, 12(6): 25-27.

[3]宋霄宏,昝日增. HPLC法测定胃炎平颗粒剂中盐酸小檗碱的含量[J].中国实验方剂学杂志, 2003, 9(1): 14-16.

[4]万玉萍,沈其萍. HPLC法同时测定复方洗液中的盐酸掌叶防己碱和盐酸小檗碱的含量[J].实用预防医学, 2002, 9(6): 653-654.